细胞存活率试验（细胞存活率试验怎么做）

本文目录一览：

• 1、用什么试剂可以检测组织中的细胞存活率
• 2、细胞生存率实验用什么方法好
• 3、测定细胞存活率为什么要多个视野下进行观察和计数活
• 4、为什么测定细胞存活率时要在多个视野下进行观察和计数死活细胞
• 5、细胞存活率测定ic50 应测定哪些时间的
• 6、细胞活性和细胞毒性检测的实验方法？

用什么试剂可以检测组织中的细胞存活率

用流式细胞仪可以直接检测细胞的存活率

你只要使细胞悬浮液稀释到一定程度

可以保证细胞通过流式细胞仪时一个一个通过就可以了

流式细胞仪是根据细胞的不同特征来分别各种细胞

例如DNA的含量的差异，借此就可以分离活死细胞了

死细胞数都可以数出来

细胞生存率实验用什么方法好

非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。

目前认为仅有肿瘤干细胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌药物敏感试验、肿瘤放射生物学试验。

集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%

（一）原理

细胞集落形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。

（二）实验用品

1.材料：Hela细胞。

2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。

3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。

（三）方法

1.平板克隆形成试验

本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。

(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。

(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。

(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。

(4)培养皿置 37℃ 、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。

(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。

2.软琼脂集落形成试验

本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。

（1）同上（1）~（3）步骤。

（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。

（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。

（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO2静置培养2-3周。

（四）实验结果

1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。

2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：

集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100

（五）注意事项

1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。

2.细胞悬液中，细胞分散度95%。

3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃ ，以免烫伤细胞。

4.接种细胞密度不宜过高。

5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。

测定细胞存活率为什么要多个视野下进行观察和计数活

细胞计数和存活测试

原理：

1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。

1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。

1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。

2. 材料：

2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.2. Erythosin bluish stain

取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl

paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline

2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)

2.4. 计数器(counter)

2.5. 低倍倒立显微镜

2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)

3. 步骤：

3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。

3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。

3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml

*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml

3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。

3.5. 范例：

T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59

死细胞数/方格：5, 3, 4, 6

细胞总数= 243

平均细胞数/方格= 60.75

稀释倍数= 2

细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106

细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106

存活率：225/243﹦92.6 %

为什么测定细胞存活率时要在多个视野下进行观察和计数死活细胞

朋友你好！

当然是为了取平均数减小各方面带来的误差啊。具体误差可能来自于：1.细胞在培养皿生长时分布的不均匀导致过密或过稀处细胞活性低 2.染色中的操作如冲洗时可能会使细胞脱落等 3.计数时的误差

生物实验的严谨性就来源于重复，这点你实验做多了就明白了。

细胞存活率测定ic50 应测定哪些时间的

按照细胞毒药物的要求，mtt法ic50为多少的时候有细胞毒性MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

细胞活性和细胞毒性检测的实验方法？

细胞数量确定

1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。

2.向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。

3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。

4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

细胞增殖和细胞毒性测定

1.将种子细胞以103-104个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养。将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。

2.将不同浓度的待测物质加入板中。

3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。

4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。

5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。

6.在读取孔板之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。

7.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

数据分析

统计分析有几种方法，您可以选择使用O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。

细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。

Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作标准曲线

1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。

2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）

3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100 μl培养基加入10 μl CCK-8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。

可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

注意事项

1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。

2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。

3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。

4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。

5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

6. 孵育2小时后，背景O.D.值一般为0.1-0.2单位。

7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值。

8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用0.2 μm的膜过滤溶液。

9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达4小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。

10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在600nm或更高波长的O.D值。

11. CCK8不能用于细胞染色。

12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

13. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）

14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。

15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。

16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。

17. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片, 450nm滤光片具有最佳灵敏度。

18. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。

19. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、 90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。

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