外泌体转录组测序方法（外泌体基因测序）

本文目录一览：

• 1、如何研究一个基因的功能？
• 2、外泌体多组学14-血浆外泌体不同建库试剂盒和比对方法和稳定性测试
• 3、转录组测序原理
• 4、从零开始学测序——转录组1
• 5、转录组测序流程步骤是哪些?
• 6、如何提高RNA量抽提质？转录组测序中抽提RNA的小技巧

如何研究一个基因的功能？

可以从一下几个方面入手：

通过查阅文献得知该基因的生物学意义或者存在的临床意义，这个研究一个基因的灵魂，好的基因选择会使后续结果事半功倍，研究有意义的基因是我们开展实验的首选。

基因组层面：可以研究DNA甲基化水平的影响，一般是和启动子区域结合起来分析，此为表观遗传学范畴。用以研究甲基化水平高低对某种疾病的作用，从而找到相对关联

RNA水平就可以考虑RNA甲基化水平或者RNA与蛋白之间的互作关系，比如5mC，m6A,MIRIP等

当然还可以通过转录组测序分析整体的结果，比如miRNA-seq,mRNA-seq，全转录组测序，通过筛选出靶基因然后进行下游验证。

细胞功能试验如基因敲除后的cck8，transwell等等，研究各个基因间的互作关系，建立关联信息，当然还可以对细胞功能后的样本进行重测组研究其他的基因。

wb实验研究蛋白层面的相对变化，或者是进行质谱分析。

当然如果还想深入的研究，也可以在细胞功能层面去研究外泌体等信息，通过测序或者细胞功能实验等都是可以的。

从此看出研究一个基因的方法还是很多的，从上游到下游，都有非常成熟的技术加一辅助，但期间最重要的是我们的前期调研以及合适的实验方案，实验对象，实验思路，实验方法，这些决定了我们的研究的最终结果。

外泌体多组学14-血浆外泌体不同建库试剂盒和比对方法和稳定性测试

最近在血液中发现的细胞外rna，包括细胞外囊泡(EVs)中的rna，再加上低起始量rna测序的进展，使科学家能够研究它们在人类疾病中的作用。迄今为止，大多数研究都集中在小rna上，而且缺乏优化长rna测量的方法。我们使用血浆RNA评估了六种长RNA测序方法在两个不同位点的性能，并报告了它们在 基因组/转录组的reads（%） 、 检测到的基因数量 、 长RNA转录本多样性 和 可重复性方面 的差异。使用最佳的方法，我们进一步比较了EV和不含EV的RNA血浆中长RNA的谱。

为了系统地比较文库构建试剂盒/条件，我们使用了来自两个独立血浆样本池的总RNA。我们将两个库中的总RNA平均分为6个不同的RNA测序试剂盒/条件，并在两个独立的位点重复构建文库。在样品制备后，我们使用Illumina的HiSeq2500平台进行了长RNA测序，以评估基因组和转录组定位百分比。

在比对之前，从每个样本fq数据中抽取50 million read pairs数据作为后续分析。

在比对到转录组时，我们查看了四种RNA biotypes定量结果：protein-coding, lncRNAs, ncRNAs, and pseudogenes

文章小结：评估指标基因组/转录组的reads（%）、检测到的基因数量、长RNA转录本多样性和可重复性方面的差异

转录组测序原理

双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。

Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生。其中Roche公司的454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。

其中Illumina市场规模占到75%以上，主要包括Miseq，Hiseq。下面👇就主要介绍它的PE（Pair End双端）测序原理：

名词：

flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane

lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置

tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的

双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp

junction： 双端测序中间一些没有测到的区域

index(barcode)：一个lane通常要测多个样品，每个样品都加上特定的序列标签，用于区分不同样品。

flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）

打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。

完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A，加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter，这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列。

进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。

reads1 与 reads2 不发生重叠

flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。

双端测序之Forward Strand ：

为什么Illumina测序会有长度限制呢？

Hiseq2000测序仪

测序仪搭配了两个flowcell，简称双流动槽。比较经典的Hiseq2500一次能产出700-800Gb数据（此处Gb为测序碱基数，不同于字节数的Gb）

数据量=单端reads长度 * 单端reads个数 * 2（PE)

测序深度=数据量大小 / 参考基因组大小

这是一个新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上，值得注意的是在测序过程中这些序列的读长也不再是相等的。

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从零开始学测序——转录组1

1. HGP时期低通量RNA序列研究方法

• Sanger测序

▷Gene clone

▷Full-length mRNA

▷dbEST/Unigene database

• Microarray技术

▷Tiling array: 瓦片层叠芯片

2. 高通量测序时代

• DNA测序：全基因组de novo测序；全基因组重测序；宏基因组测序；人类外显子组捕获测序等

• RNA测序：转录组测序；小RNA测序；非编码RNA测序（不带polyA的RNA测序）

PS：rRNA去除的RNA测序，测到的是mRNA和所有非编码RNA

• 表观基因组研究：ChIP-Seq；DNA甲基化测序

3. 非编码RNAs (ncRNAs)

指不被翻译成蛋白质的RNA，以RNA分子的形式完成其生物学功能的RNA。

目前对ncRNAs种类的界定没有同意的说法，可按功能、长度、细胞定位等具有不同的分类，其中，按功能分主要有以下两类：管家ncRNAs (house keeping ncRNAs)，包括tRNAs, rRNAs, snRNAs, snoRNAs, SRPRNA；另一类为调节ncRNAs (regulatory ncRNAs)

4. 长非编码RNAs (lncRNAs)

指的是长度大于200nt的功能RNA分子。其中有一类是带polyA，另一类不带polyA，前者的特征和mRNA类似，比如：也被RNA polymerase II转录，具有polyA信号，加帽，可被剪接等；后者没有polyA tail的lncRNAs也有剪接现象。

lncRNAs的特性：在序列上不保守，且表达量低，组织特异性强，通常与蛋白编码基因协同表达，共同参与众多生物过程。

lncRNAs的功能：主要调节蛋白编码基因的表达、稳定性及亚细胞定位，包括基因印迹的控制，X染色体的补偿，应激反应，免疫反应，细胞的分化和发育，疾病、肿瘤等，eg, 哺乳类Xist基因编码的ncRNA可使雌性两条X染色体中随机失活1条，达到剂量补偿的目的。

5. lncRNAs: Genomics, Functions, Methodologies, Modes of Actions

(1) RNA生物学研究历史

(2) ENCODE计划

ENCODE计划是HGP之后美国政府启动的来揭示人类基因组中每段DNA的功能，尝试读懂人类遗传密码。()

(3) Forms of lncRNAs

Major forms: lincRNA, Enhancer RNA, antisen-lincRNA

Other forms of lncRNAs: sno-lncRNA（在lncRNA的两端有一些snoRNA来保护）, Circular RNA（无polyA尾，头尾连接形成环形RNA，可能来源于intron剪切，也有可能是两个外显子的连接）

(4) In Cis - or Trans-

可把lncRNAs的功能大致分为两类，一类被转录出来之后就近发挥作用，直接调控旁边基因的表达，被称为function in cis-. eg, HOTTIP这个lncRNA，调控附近基因组区域的组蛋白甲基化修饰状态；女性中转录了Xist lincRNAs的那条X染色体失活。另一类lncRNA被转录出来后并不在转录位点附近发挥作用，而是到远端发挥作用，被称为Trans-acting lncRNAs。

(5) 特征

Low abundance (低表达量)，Tissue-specificity (组织表达特异性强，只在一种或少数几种组织中表达)

(6) Several well-characrerized lncRNA with detailed molecular mechanisms

(7) Four principles of nucleic acid and protein interactions

RNA-Protein, DNA-RNA, Protein-DNA, RNA-RNA 

转录组测序流程步骤是哪些?

以真核转录组测序为例，实验流程为总RNA提取-mRNA分离-建库试剂-定量-文库回收-桥式扩增-上机测序；项目分析流程为数据产出数据=数据去杂-转录组拼接-SSR分析及SNP分析-基因功能注释-基因表达差异分析-差异基因表达模式聚类-差异基因富集分析。

如何提高RNA量抽提质？转录组测序中抽提RNA的小技巧

RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录形成的一条单链，主要功能是使遗传信息能够翻译成蛋白行使生物学功能，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。当我们研究DNA的表达和调控，即我们常说的转录组测序时，首先需要做的就是从组织或细胞中分离和纯化RNA。

抽提RNA时，我们通常遵从 3点原则：1.保证RNA的完整性；2.获得比较纯的RNA；3.操作简便，稳定性强。

RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此，做转录组测序抽提RNA之前，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。

RNA抽提的方法有很多，其中常用的方法为 Trizol抽提法 和 RNA抽提试剂盒 。Trizol抽提方法为传统的抽提方法，RNA试剂盒抽提则比较方便，市面上也有很多该类试剂盒。这两种方法在操作过种种各有利弊。在做转录组测序时，我们可以根据自己的目的选择合适的方法，下面列举出了2种方法的优缺点对比，供参考。

做转录组测序时，我们为了保证抽提出的RNA的质量，每一个细节都需要谨慎操作，下面几点则是我们常常会忽视但是又很重要的小细节。

1.使用正确的细胞或组织储存条件，在样品用液氮速冻后，应该储存在-80℃，做转录组测序的样品在RNA提取之前应避免反复冻融。

2.研磨过程要迅速，彻底匀浆样品。

3.尽量使用无RNase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换；实验前移液器、工作台、玻璃器皿，尽量用RNaseZap擦拭。

4.建议分装RNA溶液进行保存，避免反复冻融，导致RNA降解。

5.使用Rnase-free的双蒸去离子水或其它缓冲液溶解RNA，否则容易导致RNA降解。

6.转录组测序时，我们一定要结合组织样本本身的特点，选择合适的抽提方案。