免疫细胞芯片检测意义（免疫细胞芯片病理分析）

本文目录一览：

• 1、举例说明在细胞结构和功能研究中基因芯片检测有哪些实际应用
• 2、生物芯片的定义\原理\作用\应用领域
• 3、“人体芯片系统”技术——动物实验终结者？

举例说明在细胞结构和功能研究中基因芯片检测有哪些实际应用

在细胞结构和功能研究中基因芯片检测有哪些实际应用

功能分类基因芯片因其对生物学通路的高针对性被视为生物学通路的重要研究工具之一。“生物学通路”（pathway-centric）研究工具是指针对研究某一生物学通路或者基因组特异性而设计的生命科学研究工具。这类工具由于是根据相关基因的现有知识组合而成的,可以使研究人员在研究中不需要再花费时间精确鉴别与此疾病或者细胞功能相关的基因是哪些。美国SuperArray公司开发的“生物学通路”研究工具包括针对各个生物学重要通路或者基因组而设立的三个产品技术平台：功能分类基因芯片，RT-PCR试剂盒和siRNA试剂盒。以功能分类基因芯片为核心，三种技术交叉使用可大大方便实验结果的验证和开展更深入的研究。

例如，利用SuperArray公司的“生物学通路”研究工具，研究者可以快速拟定并进行下列有关细胞凋亡的实验：

用人细胞凋亡基因芯片检测并比较正常样本和疾病样本中与细胞凋亡相关基因的改变。

用单基因（Single Gene）PCR试剂盒验证某细胞凋亡相关基因的表达变化或者用多基因（MultiGene-12）PCR试剂盒验证一个基因家族的表达变化。

用siRNA试剂盒逐个敲除与细胞凋亡相关基因的表达或者用新推出的siRNA阵列板对某一个基因家族进行敲除。

再用人细胞凋亡基因芯片检测敲除某基因后细胞凋亡相关基因的表达变化。

图1 三种研究工具互相辅助进行的基因研究方法可加速我们对重要疾病或者细胞功能通路的研究，大大简化研究方案的设计，加快实验进程，并降低实验的整体费用[15]。

以下通过功能分类基因芯片和siRNA技术结合证明TBL1/TBLR1参与NFkB信号通路[16]的实验是生物学通路研究工具在科研中应用的一个很好的例子：

生物芯片的定义\原理\作用\应用领域

生物芯片技术是随着"人类基因组计划"（human genome project, HGP）的进展而发展起来的，它是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片（1）。本文主要讨论基因芯片技术，它为"后基因组计划"时期基因功能的研究提供了强有力的工具，将会使基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。

1 基本概念

基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。

2 技术基本过程

2．1 DNA方阵的构建

选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物，并作相应处理，然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针;（2）或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列，再纯化、定量分析，由阵列复制器（arraying and replicating device ARD），或阵列机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片（3）。

2．2 样品DNA或mRNA的准备。

从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，好于传统PCR技术，他们在靶DNA上设计一对双向引物，将其排列在丙烯酰胺薄膜上，这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁；Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为有效快速（4）。

在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。

2．3 分子杂交

样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测，杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高；若用于突变检测，则杂交条件相反（5）。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次可以对大量生物样品进行检测分析，杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式，使分子杂交速度缩到1min，甚至几秒钟（6）。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸（PNA）为探针效果更好。

2．4 杂交图谱的检测和分析

用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏`、快速，有取代荧光法的趋势。

3 应用

3．1 测序

基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%（7）。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性（8）。

3．2 基因表达水平的检测。

用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。（9）Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实（10）。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了（11）。

3．3 基因诊断

从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如，Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用（12）。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

3．4 药物筛选

如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再用m RNA 构建c DNA表达文库,然后用得到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。或者,利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。（13）生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。

3．5 给药个性化

临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异，如药物应答基因，导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S,P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如，现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3-12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加（14）。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。

此外，基因芯片在新基因发现、药物基因组图、中药物种鉴定、DNA计算机研究等方面都有巨大应用价值。

4 基因芯片国内外现状和前景

自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统（15），此后世界各国在芯片研究方面快速前进，不断有新的突破。美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。98年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析协会（Genetic Analysis Technology Consortium）以制定一个统一的技术平台生产更有效而价谦的设备，与此相呼应，英国的Amershcem Pharmacia Biotechnology公司也在同一天宣布将提供部分掌握的技术以推动这项技术的应用（16）。美国关于芯片技术召开了两次会议，克林顿总统在会上高度赞赏和肯定该技术，将基因芯片看作是保证一生健康的指南针（17）。预计在今后五年内生物芯片销售可达200-300亿美元；据《财富》杂志预测（97.3），在21世纪，生物芯片对人类的影响将可能超过微电子芯片。

“人体芯片系统”技术——动物实验终结者？

在研制新型处方药和解毒剂的早期阶段，研究人员会进行大量动物实验。实际上，动物实验不仅成本高耗时长，而且动物身体与人类身体的生理机能不同，研究人员也无法从中得到对人体完全有效的数据。即便能进行人体实验，某些实验结果将损害被测试者的健康，不符合人道准则，法律禁止这样的实验。

在不进行动物实验或人体实验的情况下，有没有一种方法让科学家了解害化学物质、病毒或毒品对人体产生的影响，并获得准确的人体实验数据？

为了实现上述目的，美国劳伦斯利物莫国家实验室正在研制一套“人体芯片”；这套芯片是一套微型人体器官复制品，综合运用了生物学和工程学技术，将微流体技术和多电极阵列技术相结合。

人体芯片使用聚合物这样的合成材料制造。此类材料制造的器官芯片可能是透明的，可以使用显微镜来观察细胞情况。器官芯片采用人体细胞培养，结构十分精细。只要具备合适的条件，芯片内的人体细胞能自然地生长，就像在人体内一样；这些细胞的功能及对外来刺激的反应也和在人体内一样。微流体的技术被用来向器官芯片里的细胞提供营养，向细胞注入与血液成分类似的液体。值得注意的是，器官芯片不含有完整器官，只是将相关器官的细胞培植在芯片里。

劳伦斯利物莫国家实验室的人体芯片项目被称为iCHIP平台，由四个生物学系统组成：中央神经系统（大脑）、外周神经系统、血脑屏障系统和心脏系统。

戴夫·欶斯卡是劳伦斯利物莫国家实验室的工程师，也是iCHIP平台的“大脑芯片”研制团队的领导人之一，大脑芯片是模拟人体中央神经系统的装置。戴夫·欶斯卡说道：“这是一个测试平台，用来检测各种新药。只要研究人员有一套类似人体环境的系统，研究人员就用不着进行周期冗长的动物实验，动物实验提供给我们的信息不一定与人体相关。”

劳伦斯利物莫国家实验室研发团队将他们的精力主要用来研究人体大脑；他们试图弄明白神经元如何互动，对化学刺激会产生怎样的反应，例如大脑受到咖啡因、阿托品、辣椒素以及其他化学物质等激后的反应。

iCHIP平台将多种脑细胞以混合方式培植在一个装置里。为了研究人体大脑，初级神经元被植入一个微电极阵列装置，该装置能模拟人体大脑的四个区域（海马区、丘脑区、基底神经节和脑皮层）。在脑细胞长成后，将一种化学物质（例如阿托品）注入微电极阵列，神经元的生物电活动情况将被记录下来。

欶斯卡表示：这种装置的理念就是让观察到大脑更复杂的整体反应，我们之前无法做到这一点；初步结果显示海马区细胞和脑皮层细胞能在芯片里存活数月，这些细胞的反应将被记录并予以分析。

人体内有一套被称为血脑屏障的重要机制，该机制能在化学物质或毒物抵达中央神经系统之前，对这些物质进行过滤，这是人体的重要功能之一。劳伦斯利物莫国家实验室的工程师莫妮卡·莫亚领导的研发团队试图利用iCHIP平台复制出人体血脑屏障。莫亚他们使用的装置采用微管和微流控芯片（该芯片采用微型蚀刻管道而不是微管）来模拟血液流经大脑。莫亚的研发团队用咖啡因和其他化学物质对该装置进行了测试，以确保该装置正常工作以及装置内的细胞对这些物质反应与人体大脑一致。

莫亚说道：血脑屏障是大脑的门卫，让血液里的营养物质进入大脑，阻止潜在的有毒物质进入大脑；但血脑屏障的功能太过有效，可能阻止了一些治疗药物进入中央神经系统。一套真实的人体实验血脑屏障模型将有助于研究人员研究血脑屏障的渗透性；作为一套用于药物研发的体外模型，iCHIP平台的用途让人难以想象。研制iCHIP平台能促进新型癌症药品和疫苗的研发以及提高对生物武器防御措施功效评估的准确性。

科学家希瑟·恩赖特是外围神经系统研究团队的领导人，外围神经系统是将大脑与四肢及其他器官连接的神经系统。外围神经系统装置是多个微电极阵列嵌在玻璃上，微电极阵列内植入了脊椎神经细胞。类似与辣椒素这样的化学物质（用于研究疼痛反应）就能通过一个小型精确泵注入iCHIP平台，以刺激微电极阵列里的神经细胞。

微电极将记录神经细胞发出的电信号，能在不损伤神经细胞的情况下，让研究人员观察神经细胞对刺激做出的反应。与现有技术相比，iCHIP平台的这项技术极具优势。恩赖特表示：“像iCHIP平台这样的多电极阵列研究方式能让研究人员对神经细胞进行多次观察实验，研究人员能最大限度地从中获取数据。当对初级人体细胞进行测试时，iCHIP平台的这种功能显得尤为重要。例如，当研究人员观测人体细胞暴露在未知化学物质反应，细胞暴露数小时的反应与暴露数周乃至数月的反应是不同的。iCHIP平台提供了一种评估人体细胞在一段时期内的健康程度和功能变化的无损观察方法。”

此外，劳伦斯利物莫国家实验室早期还进行过在一个芯片上复制心脏的研究。在电刺激下，芯片上的心肌细胞成功地进行了跳动，研制心脏芯片的目的就是同时对心肌细胞的电生理学和运动进行研究。

伊莉莎白·惠勒是iCHIP研发团队的主要研究员，按照她的说法，iCHIP研发团队下一步将整合各个系统，从而建立一套完整的测试平台，用于研究某些基础科学问题；最终建立一个完整的人体平台，i不仅能为疫苗提供相关人体数据，还能为了解疾病机制提供有价值的信息。在将来某一天，从人体芯片系统得到的信息将用于研制定制药品。”

要停止全部动物实验和人体实验，仅仅依靠器官芯片就取得准确的实验数据，研究人员还有有一段很长的路要走，可能还得耗费十多年时间。在现阶段，一些生物医药机构还无法得到适用的器官芯片。人体免疫系统对外来物质的反应是一种相当复杂的过程，尤其是人体神经系统对药物的反应。随着相关技术的改进和研究人员对器官芯片更深的了解，越来越多的实验动物将被器官芯片取代。