细胞复苏步骤视频（细胞复苏的方法）

本文目录一览：

• 1、求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤
• 2、求细胞复苏方法步骤和注意事项
• 3、死的细胞如何才能复活？
• 4、细胞复苏的步骤

求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤

贴壁细胞冻存实验准备：

将15mL离心管、冻存管、PBS缓冲液、移液管、电动移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒灭菌；

细胞完全培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、细胞冻存液等从4℃冰箱中取出后，复温至室温，备用；程序降温盒复温至室温备用。

贴壁细胞冻存操作步骤：

1. 从培养箱中取出准备冻存的细胞；

2. 显微镜下观察细胞状态并拍照记录；

3. 酒精消毒培养瓶后放入安全柜中；

4. 吸去多余的培养基，加人2~3ml PBS缓冲液润洗一次；

5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；

6. 消化1min左右，在显微镜下观察细胞消化情况；

7. 消化完全后，加3ml完全培养基终止；

8. 将细胞悬液移入15ml离心管中离心，1000rpm/min（约200g）离心3-5min；

9. 吸去多余的液体，向细胞沉淀中加入适量的冻存液，轻轻吸打混匀；

10. 按比例分装至冻存管中；

11. 贴好标签后放入梯度冻存盒中；

12. 将冻存盒放入-80℃，降温过夜后，移入液氮中保存。

注意事项：

1）细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；

2）不同细胞消化时间有差异，以实际镜检结果为准，大部分细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可中止消化，消化时间不宜过长；

3）应选择汇合度80%-90%左右，细胞处于对数生长期时进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；

4）冻存细胞保存温度应低于-130℃，不可在-80℃长期保存。

求细胞复苏方法步骤和注意事项

博凌科为解答：【材料】1.常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。7.记录复苏日期。【注意事项】1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

死的细胞如何才能复活？

死细胞的主要表现为蛋白质的凝固和遗传物质的复制停止，酶的活性也大大降低，我认为其中最主要的是遗传物质的复制停止只要让遗传物质的活性持久下去也许就会实现死细胞的复活，因为遗传物质直接影响蛋白质的合成（也就是说影响细胞的各项生理机能且大部分的酶为蛋白质）所以也影响着各种生物催化剂的合成，简单的说，要想死细胞复活只要将失效遗传物质活化，且加入合成蛋白质所需的各种嘌呤，嘧啶和部分糖，脂类，和必须氨基酸，血清等适合动物细胞生存的营养环境，还有适宜的pH，温度等外界条件应该死细胞可以复活。（因为学习有限，具体怎样激活遗传物质使其再具活性须请教高等学历的生物学家或教授等！）

还有电击的方法可以使细胞复苏，因为人本身就会产生电流来控制神经在外界的刺激下很有可能使细胞内再具有生存的能量，也许可以复苏，就像人们平时说的“炸尸”其实就是人死后在太平间等地接触电流后世部分细胞复苏而产生的现象，但这种现象持续时间不会太长，不能达到细胞的长时间复苏。

细胞复苏的步骤

真核细胞通常悬浮在带有血清和冷冻剂的培养基内，保存在-196°C 的液氮中。如果是商业订购的，通常储存在用干冰包裹的冻存管中。所以冻存后的细胞必须快速解冻后立即培养，以获得最大的生存能力，为了除去冻存时的添加剂， 24 小时后要更换培养基。

一、材料

培养基， 37’C 预热

培养瓶

装有70 ％乙醇的烧杯

1ml 、10ml 的移液管、移液器及移液头

二、步骤

把冻存细胞的管子在37’C 的水浴融化，快速摇动， 1分钟内使管内的细胞融化。

把融化的管子浸入装有70 ％乙醇的烧杯内，整个实验在超净台内进行。

小心打开冻存管，不要让乙醇浸入管内。

将冻存管内的细胞转移到培养瓶中，并立即加入预热的培养基。

盖好培养瓶的盖子，培养24 小时。

用新培养基替换老培养基。

继续培养2~3 天或按说明书上的建议进行操作。

三、温馨提示

1.融解的细胞必须马上培养，如果来不及培养，就保存在液氮中。

2.细胞通常冻存为1 ml 的体积，加入新的培养基至10ml 。

3.可以在融化了冻存细胞后，把细胞离心下来，并用新鲜的培养基重新悬浮细胞，这种做法只适用于那些对冻存剂敏感的细胞，或者笫二天因为有事不能更换新培养基的情况。