免疫组化抗体是怎么生产的（免疫组化抗原）

本文目录一览：

• 1、免疫组化是什么？
• 2、免疫组化一抗怎么制备？
• 3、免疫组化中，一抗、二抗的制备方法？原理？
• 4、免疫组化的操作步骤是什么？
• 5、免疫组化原理是什么，能否给个通俗的解释

免疫组化是什么？

第一、免疫组化，主要是用于病理诊断预后判断和治疗效果的预测，能够提高病理诊断水平，对临床有指导意义。例如恶性黑色素瘤HMB45为阳性表达，可以帮助明确诊断。除此之外，还有用于疾病的病理诊断和分型、探讨其发病机制，例如胃肠道间质瘤其C-kit基因突变可以用靶向药物治疗，效果较好。

免疫组化一抗怎么制备？

最方便的办法是直接购买商品化的，尤其是对于一些常见抗原的检查。因为免疫组化实验步骤繁多，非常复杂，如果自己制备抗体，还需要大量的时间来免疫动物（几个月），获得抗体后还要筛选，优化。因为很多抗体公司的IHC抗体都是经过很多实验验证的，直接购买使用，效果也有保障。

以前很多医院做免疫组化买的是lab

vision的抗体。或者是通过biocompare查有哪些公司提供你要的抗体。

如果已经有抗体了，基本上就是用封闭缓冲液，稀释到建议的浓度，孵片就行了。

免疫组化中，一抗、二抗的制备方法？原理？

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一) 原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二 用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

↓

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔

中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

↓

于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，

37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

↓

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(三) 试剂器材

1. 试剂

(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

Na�CO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸馏水至1000ml

(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0.2克

Tween-20 0.05％ 0.5ml

加蒸馏水至1000ml

(3) 稀释液：

牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

(4) 终止液(2M H2SO4）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):

0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml

0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml

加蒸馏水50ml。

(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:

TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml

底物缓冲液(PH5.5) 10ml

0.75％H2O2 32μl

(7) ABTS使用液:

ABTS 0.5mg

底物缓冲液(PH5.5) 1ml

3％H2O2 2μl

(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。

(9) 正常人血清和阳性对照血清。

2. 器材:

(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

(四) 注意事项

1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。

(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

免疫组化的操作步骤是什么？

1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2.缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注:孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清，这一步可以省略。)

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子)，在室温下孵育 20 分钟。

10 .缓冲液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ，在室温下孵育 30 分钟。

(注:HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

12 .缓冲液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

14 .自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

简介：

免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

基本原理：

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

免疫组化原理是什么，能否给个通俗的解释

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。