外泌体代谢组学步骤（代谢组学方法与应用）

本文目录一览：

• 1、代谢组学细胞样本收集
• 2、【代谢组学】代谢组学与其他组学数据的整合
• 3、代谢组学的研究方法
• 4、做好代谢组学研究的关键在哪里？

代谢组学细胞样本收集

代谢组学是基因组学、转录组学和 蛋白质组学 的下游补充，提供生物系统生理状态的总体评估。它代表了遗传调节的终点及其对细胞中酶活性和内源性生化反应变化的影响。结合特征选择、 模式识别 和多元数据分析方法，代谢组学分析旨在提供血液、尿液、组织或细胞中代谢物水平变化的综合评估。

细胞样本是代谢组学分析的重要样本，细胞作为生物代谢的第一场所，在代谢组学分析中具有重要的研究意义。近年来，在众多医学、动植物生理学和细胞生物学研究中，如疾病的标志物的识别和检测等，应用于细胞样本的代谢组学起到了重要的工具作用。

基于超高效液相色谱-质谱联用技术的非靶向代谢组学分析流程一般包括： 样品的收集和预处理、代谢物提取、LC-MS全扫描检测、数据预处理、统计分析及差异物结构鉴定。 其中第一步，样品的收集和重复设置尤为重要，直接关系到实验结果以及数据分析。

代谢组学方法已广泛用于动物和植物组织、酵母和细菌，针对不同的组织和细胞类型开发了不同的样品收集技术。

与其他样本不同的是，细胞样本收集后，需要马上进行淬灭过程，即快速的使细胞内的酶失活，从而终止细胞内代谢物的变化。细胞样本的收集过程中， 可以使用液氮进行快速淬灭，但不能将液氮直接倒入细胞，这样会导致细胞膜直接破碎， 使其内容物直接流出，影响后期对细胞内代谢物的分析。

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Sellick等人（2011）对细胞的代谢物提取过程进行了优化和验证，并评估了淬灭过程对代谢物的提取效果，过程中代谢物的泄漏情况，前处理过程中去除污染杂质的效果以及样品 质谱 分析结果。以下是细胞样本的收集及细胞培养液上清收集的科学方式，请各位老师查收 @科研人

1、细胞收集

收集步骤：

针对 悬浮细胞、 贴壁细胞 等来自培养基培育的细胞，需要考虑到培养基和 细胞体 的分离，且要考虑到收集完成后细胞内部的代谢活动是否继续，基于这种因素，一般细胞样本在收集过程中，需要增加淬灭这一步骤。

细胞样品收集前采用细胞计数器或细胞计数系统计数，约5 106~1 108个细胞的量是符合代谢组学分析要求的。

贴壁细胞收集过程：

1.快速倒掉培养基，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液。

2.加入4℃预冷的PBS反复冲洗2~3次（若用移液器加，则靠着培养皿壁加入，以免将细胞冲起）倒掉PBS。

3.用移液器吸尽残余的PBS，将培养皿底部（外壁）接触液氮，淬灭细胞（1*107个细胞为宜），

4.加入500微升预冷的甲醇-水（4：1，V/V），用细胞刮刀将细胞刮下，用移液器转移至1.5 mL的离心管中，

5.再向培养皿中加入500微升预冷的甲醇-水（4：1，V/V），将剩余的细胞尽量全部转移至1.5 mL的 离心管 中，使用封口膜将离心管密封（也可淬灭细胞后不加入提取液直接刮下转移细胞至离心管）-80度冻存。

注意：

（1）若加入提取液一定要用封口膜封严

（2）若做脂质、脂质拟靶向、 靶向代谢 等，不可按甲醇水（4:1）方法操作，应淬灭细胞后不加入提取液直接用刮下转移细胞至离心管

（3）液氮淬灭细胞时，请小心离心管质量，防止离心管破碎导致样本受损

（4）取对数生长期，培养至同一时期的细胞，建议多准备样本，以备后续使用

（5）贴壁细胞收集时如遇培养皿较大，1mL试剂无法完全转移，建议加入最大试剂体积不超过3mL

（6）贴壁细胞的收集也可使用胰酶消化后，低速离心，去掉培养液上清，再使用 PBS溶液 清洗1-2次，弃掉PBS上清溶液，将收集好的细胞沉淀液氮淬灭后进行后续实验

悬浮细胞收集过程：

1.连同培养基转移到进口的15 mL的离心管中，低速离心5 min（低于3000 rpm），使细胞沉淀于离心管的底部（1*107个细胞为宜）。

2.倒掉培养基（尽量倒干净），用PBS反复冲洗2~3次。

3.标记离心管，将离心管的尖端插入液氮中，淬灭细胞沉淀1 min，然后-80度冻存。

注意：

（1）操作尽量迅速，培养基尽量倒干净，如有滤纸，建议用滤纸将残留的培养基吸尽。

（2）取对数生长期，培养至同一时期的细胞，建议多准备样本，以备后续使用。

保存介质

保存介质与此后的提取结果有较大关联，细胞在储运过程中难免会发生冻融，可能会对实验结果有较大影响。如无必要，我们建议样品弃掉上清和PBS后，直接将剩下的细胞沉淀送样进行分析，这样做可以尽量避免由于介质的原因导致实验结果发生偏差。如细胞必须使用介质进行保存，则建议您使用甲醇水混合溶液进行保存，最佳比例为甲醇水溶液（"margin-top: 0px; margin-bottom: 0px; clear: both; box-sizing: border-box;"

注意：

细胞分离过程中，由于细胞脆弱，一些不当操作会导致细胞破碎，从而影响代谢组学分析过程，因此有如下注意事项

1.样本收集过程中全程操作不宜过度剧烈，切勿涡旋震荡、高速离心或超声等，同时避免反复冻融，以保证细胞膜不会破损，减少代谢组学分析影响。

2.使用PBS清洗时，切勿冲走细胞，清洗充分后，尽量将PBS完全倒掉。

3.淬灭时注意控制条件和时间，一些哺乳动物的 细胞系 不能接受-45℃以下的淬灭条件，可能会导致细胞膜破碎。

4.切勿将液氮直接倒入培养皿中淬灭，会导致细胞破碎，代谢物流出。

2、细胞培养液上清收集

收集步骤：

1.取细胞培养液约2mL，低速离心，将细胞沉淀分离。

2.取1mL（建议量，最少500μL）以上上清液，-80℃储存样本，足量干冰寄送样本。

注意：

培养液上清由于其样品属性，一般情况下，样本代谢物含量较低，且含盐含糖量较高，分析难度较大，对实验仪器和实验方法均有较高要求，需要注意以下几点：

1.确定需要进行代谢组学分析后，请进行售前联系，提交培养基内容物，以确定能否进行代谢组学分析操作。（欢迎致电：17317724501咨询）

2.样本收集时，严格避免高速离心、剧烈晃动、过高或过低温度导致培养基中的细胞破碎。

3.收集后避免反复融冻，全程低温储运，长距离运输使用干冰，直至分析。

【代谢组学】代谢组学与其他组学数据的整合

主要内容：

1.多组学数据整合概述

2.主要分析软件汇总

3.数据预处理的方法

1.多组学数据整合概述

1.1 多组学数据整合的现实意义

在研究疾病和其他性状或扰动的分子机制时，在一个以上的组学平台上进行分子分析是一种常见的做法。 

意义：多组分平台数据的整合分析为生物系统提供了更全面的分子特征，有可能改进疾病分子机制的发现以及诊断和预后预测模型。 

目的：整合分析主要是为了更好地确定不同类型的生物分子是如何关联的（例如，代谢数量性状位点（mQTL）分析），为了确定与表型或疾病结局显著相关的分子途径，或者提高预测性能，例如，在生物标记物发现和诊断或预后应用的情况。 

如果数据集不是从同一个人那里收集的，那么跨组学数据集的整合分析的范围也是有限的。

2. 分析使用的原材料

2.1 可以参与分析的“材料”

1.软件：所有可以进行统计分析和数据可视化的软件都可以使用（例如，R）。 

2.计算资源：原则上，所有分析都可以在功能相当强大的台式计算机上进行，尽管建议在某些分析中使用更强大的计算资源，例如计算服务器。 

3.研究设计：主要考虑匹配样本研究设计，在多元分子表型（-omics）平台上分析来自相同个体的生物样本。例如，在匹配样本设计中，单个血液样本可以分成两份，其中一份在代谢平台上分析，另一份在转录平台上分析。然而，匹配样本设计可以基于同一生物样本小份体液，但也可以不一定要基于，例如在同一时间点从同一个人采集的血液样本和另一组织活检样本，即匹配。

4.预处理。分析中使用的数据集需要适用于特定分子分析平台的标准方法先行进行预处理，包括质量控制和排除潜在异常值和/或非典型观测。

3. 数据分析的方法

3.1 mQTL分析：代谢特性的遗传驱动因素

描述遗传变异（通常以单核苷酸多态性（SNPs）的形式）与代谢产物丰度之间的统计关联，为理解代谢的遗传驱动因素提供了手段。mQTL分析需要来自相同个体的代谢谱数据和基因分型数据（SNP阵列或DNA测序数据）。基于群体的mQTL研究采用类似于全基因组关联研究的统计方法，不同之处在于表型响应变量是代谢丰度。mQTL分析通常是通过全基因组的单变量关联分析进行的，通常假设一个附加的遗传模型，其遗传效应主要由等位基因的数量编码。对于每个代谢物或代谢特征，进行全基因组扫描，以测试与遗传变异的关联。mQTL分析的结果是关于影响代谢丰度的候选基因驱动因素的信息。

3.1.1 mQTL分析过程

1.预处理和质控SNP分析数据，去除具有低质量位点和具有次等等位基因频（MAF）的变体；

2.预处理和质控代谢组数据（取决于平台和样本类型）； 

3.对于每一对代谢物—遗传变异位点： 

    a)拟合一个统计模型来检验代谢物-遗传变异的关联。通常使用线性模型，以代谢特征为响应变量，以遗传变异和相关协变量（如性别、年龄、批次）为预测变量； 

    b)对与遗传效应有关的模型参数进行统计零假设检验（如Wald检验或似然比检验），以确定p值

    c)保存与每个遗传变异-代谢物对儿的遗传效应相关的p值（和相关参数估计）。

4.调整保存的p值向量以进行多次测试，例如基于错误发现率（FDR）的方法。 

5.使用FDR调整的p值和可接受的FDR水平（通常0.05）确定哪些mQTL模型具有统计显著性。

6.对于重要的mQTL模型，对模型执行额外的质量控制（高杠杆点，检查残差分布），以确保没有异常值或其他非典型观测影响结果。 

7.以表的形式展示结果，表中列出了重要的SNP-代谢物对儿，并展示了排名最高的重要模型。典型图表类型包括曼哈顿图，对于每个重要的代谢物-SNP对儿，绘制代谢物丰度与主要等位基因数（通常编码为0、1或2）的比较。 

8.重要mQTL变异的功能解释可以通过确定变异体是否位于基因的编码区来进行，这将表明该基因与相关代谢物之间的功能关系。如果变异体不位于基因的编码区，则可以基于与mQTL变异的基因组距离来确定候选功能基因，在mQTL变异体附近定位的基因将被视为主要功能候选基因。

3.2 基于代谢途径的整合分析

代谢途径分析提供了一种方法来确定特定的分子路径或生物过程是否与特定的生物扰动相关，如疾病状态。 

代谢途径分析提供了一个将更广泛的生物学功能分配给分子层面的机会，并且可以帮助对研究结果进行生物学解释。 

进行代谢途径分析的两个最常见的框架是基于过度代表（OR）（或）或基于秩的假设检验。 

这里我们采用基于秩的检验方法，其中基因集富集分析（GSEA）是在转录组数据背景下进行代谢路径分析的一个常见例子，它也可以应用于代谢组数据。使用GSEA或OR分析的途径分析也可以通过结合代谢组学和转录组学数据来进行，好处是从这两种数据类型中收集信息以确定代谢途径富集程度。 

代谢途径分析的结果是基于代谢组学和转录组学数据中的证据，给出关于哪些分子途径与所研究的表型相关的信息。

3.2.1 代谢途径分析过程

1.使用平台特定的方法对转录组和代谢组数据进行预处理和质控。 

2.将代谢物标识符分配给轮廓代谢物，然后可以将其映射到生物途径。我们假设转录组数据已经有了带有变量标准标识符的注释信息（例如，Ensembl、Entrez或基因ID），它们也可以映射到路径。 

3.对每个带注释的代谢物和每个转录组变量进行单变量关联分析，以确定它们与感兴趣的表型或结果的关联，例如病例-对照状态。在基于秩的（GSEA）分析中，秩是由每个变量的估计效应大小（例如，固定效应模型中的系数）决定。在OR分析中，重要的代谢物和/或基因集合由每个变量的统计零假设检验确定。

4.分别使用转录组和代谢组数据进行途径富集分析，例如GSEA，并存储与每个路径相关的p值。 

5.结合来自转录组和代谢组数据代谢途径丰度证据，确定两个数据集的组合路径显著性。可以使用基于排列的测试来确定显著性。 

6.以表的形式显示结果，表中列出了与p值和FDR调整p值相关的重要途径。

3.3 结合代谢组学和其他组学数据进行预测建模

预测建模，例如分类或回归，是生物医学研究中的一个共同目标，可以针对疾病诊断、亚型或预后等的预测。 

有时，这种模型的预测性能可以通过包含一种以上的分子表型（-omics）数据来提高。

如果额外的数据（即额外的分子表型）有助于提供补充与预测感兴趣的结果相关的信息，则预期会出现改进的预测性能。如果预测性能没有得到改善，这意味着添加的数据要么根本不是预测性的，要么只是在第一个数据集中捕获的内容上提供冗余信息。 

这项分析的结果是哪个分子表型平台提供了最好的预测信息，如果差异在统计学上是显著的，并且如果两种分子层面数据的联合（组合）建模提供了一个改进的预测模型。

3.3.1 预测模型过程

1.预处理和质控代谢组学数据和从同一个体收集的额外分子数据，例如转录组数据。

2.选择适合高维数据的多元预测模型（如PLS、OPLS-DA或lasso）。在后续步骤中使用此模型。 

3.应用（嵌套）交叉验证优化模型参数并评估预测性能，或使用外部测试集评估预测性能。在分类的情况下，受试者工作特征曲线（ROC）和ROC曲线下面积（AUC）通常用于确定分类性能。分别基于各分子表型平台的数据评价模型的预测性能。 

4.基于来自两个分子分析平台的数据优化和评估模型的预测性能（参见步骤3），在这两个平台上，数据通过变量的直接连接进行组合。

5.比较单个数据集和组合数据集之间ROC曲线和ROC-AUC的差异。如果需要，统计零假设检验可用于确定ROC-AUC估计值是否存在显著差异。 

6.可用于未来数据预测的最终预测模型使用优化模型参数（步骤3和4）使用数据集中的所有观测值进行拟合，而不是基于交叉验证训练集拟合的模型。 

7.以表格的形式呈现结果，表中分别包含每个数据和组合模型的交叉验证（或外部测试集）的AUC估计值。另外还包括相应ROC曲线的可视化和与AUC值比较相关的假设检验p值。

代谢组学的研究方法

代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析 （metabolomic fingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析（metabolomic profiling）,研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究。

对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。更进一步说，质谱（MS）并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化。采用核磁共振（NMR）的方法，可以弥补色谱的不足。剑桥大学的Jules Griffin博士，正在使用质谱与核磁共振结合的方法，试图建立机体中的完整代谢途径图谱。Griffin用核磁共振检测高丰度的代谢产物，由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。

过去，只有毒理学方面的研究使用核磁共振，而质谱只在植物代谢研究中采用。如今，这两种方法在代谢组学研究中已经普遍使用。为在不同样品间进行有意义的比较，研究人员必须结合使用这两种方法获得的大量数据进行分析。此外，还需要结合基因组学研究获得的数据。

Gary Siuzdak博士在美国克利普斯研究院（TSRI）从事生物信息学问题的研究，他设计了一个分析来自不同样品代谢产物变化的实验方案。研究人员可以通过生物信息学软件XEMS比较不同的数据，从而识别出代谢产物。软件提供了所有代谢产物的分子量数据，这些代谢产物浓度因不同的个体而变化。公众可以从网上免费获取这些数据。

Siuzdak博士表示，他们正采用综合研究的方法进行代谢组学研究，试图检测出尽可能多的代谢产物，超越人们过去使用方法所能达到的目标。通过个体研究，希望能在一定程度上识别出与应激有关的新分子，这些应激物可能是一种疾病，一种敲除酶，或者是其他的物质。

做好代谢组学研究的关键在哪里？

首先明确代谢组学的核心任务。对小分子代谢物的定性、定量分析并发现差异代谢物：（1）对生物体系中的内源性代谢物及其变化规律进行表征；（2）以差异代谢物作为核心对生命奥秘进行解析。而基于色谱/质谱联用的分离分析技术具有灵敏度高、选择性好、动态范围宽、信息丰富等优点，已成为代谢组学研究的主流技术平台。

其次明确代谢组学的研究方法。对于非靶向代谢组学而言，色谱与高分辨质谱的联用必不可少；而对于靶向代谢组学而言，基于多反应监测（MRM）模式的三重四极杆质谱被认为是质谱定量的  “金标准”。近年来，拟靶向技术由于结合了非靶向和靶向分析技术的双重优势，在代谢物分析的覆盖度上与非靶向方法接近，在灵敏度上与靶向分析一样，迅速发展成为代谢组学的主流研究方法。拟靶向代谢组学主要包括三个步骤：（1）基于四极杆飞行时间质谱的非靶向分析；（2）母离子/产物离子对的选择及检测参数优化；（3）使用三重四极杆或QTRAP质谱采用MRM模式（包括上述离子对）对样品进行分析。

关键点有哪些？代谢组学整个研究过程可以细分为20多个步骤，若每一步准确率为70%，最终结果的准确率不足0.1%，因此必须确保每一步（尤其是关键步骤）都规范、准确，才能保证研究结果准确、可靠。影响代谢组学研究质量的关键环节包括：（1）系统科学的研究方案；（2）样本收集、分组、储存、前处理、质量控制；（3）数据采集与质量控制；（4）数据处理、分析；（5）差异分子筛选与鉴定；（6）分类模型构建与验证；（7）数据库自建、管理与使用。这些环节受制因素较多，需要参考研究论文、技术规范、注意过程控制，采用专业的技术和工具支持才能获得高质量的研究结果。

为什么关键？围绕快速、有效地发现分子和标志物这一目的，精准和高通量正成为引领发展的方向。代谢组学研究需要满足生物医药、食品等行业的个性化分子智能识别需求，所以需要分子智能识别检测技术做支撑，需要自主知识产权的核心算法，才能保证专业化的组学、质谱数据处理、数据挖掘。

总结来说，在组学研究过程中，只有做好分子特征检测、差异分子筛选、差异分子鉴定、分类模型构建、数据库自建等关键步骤，才能得到最好的组学研究结果。