细胞复苏步骤流程图（细胞复苏的过程）

本文目录一览：

• 1、细胞复苏的步骤
• 2、细胞培养的具体步骤
• 3、细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
• 4、细胞复苏步骤和注意事项
• 5、A549细胞的复苏方法？

细胞复苏的步骤

真核细胞通常悬浮在带有血清和冷冻剂的培养基内，保存在-196°C 的液氮中。如果是商业订购的，通常储存在用干冰包裹的冻存管中。所以冻存后的细胞必须快速解冻后立即培养，以获得最大的生存能力，为了除去冻存时的添加剂， 24 小时后要更换培养基。

一、材料

培养基， 37’C 预热

培养瓶

装有70 ％乙醇的烧杯

1ml 、10ml 的移液管、移液器及移液头

二、步骤

把冻存细胞的管子在37’C 的水浴融化，快速摇动， 1分钟内使管内的细胞融化。

把融化的管子浸入装有70 ％乙醇的烧杯内，整个实验在超净台内进行。

小心打开冻存管，不要让乙醇浸入管内。

将冻存管内的细胞转移到培养瓶中，并立即加入预热的培养基。

盖好培养瓶的盖子，培养24 小时。

用新培养基替换老培养基。

继续培养2~3 天或按说明书上的建议进行操作。

三、温馨提示

1.融解的细胞必须马上培养，如果来不及培养，就保存在液氮中。

2.细胞通常冻存为1 ml 的体积，加入新的培养基至10ml 。

3.可以在融化了冻存细胞后，把细胞离心下来，并用新鲜的培养基重新悬浮细胞，这种做法只适用于那些对冻存剂敏感的细胞，或者笫二天因为有事不能更换新培养基的情况。

细胞培养的具体步骤

一、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

具体步骤：

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。

加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要求：

1．无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4．气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。

注意事项：

（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。

（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照步骤操作。

（3）预防细胞污染

（4）防止细胞交叉污染

扩展资料：

动物细胞培养：

在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。

⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。

参考资料：细胞培养-百度百科

细胞复苏步骤和注意事项

博凌科为解答：【材料】

1.常规细胞培养仪器设备

恒温水浴振荡器。

2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】

1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。

4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7.记录复苏日期。【注意事项】

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作

较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除

DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，

死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液

体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。

5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响

细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是

10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

A549细胞的复苏方法？

1.先从液氮罐内迅速拿出需要复苏的细胞，迅速放入37摄氏度的水浴中，并不停的摇晃，注意瓶口不要碰到水面，以防污染细胞；

2.将盛入37摄氏度水浴中的细胞连同烧杯一起带入细胞房，待细胞均匀融化后，拿出；

3.将细胞悬液倒入离心管，加入3-4滴完全培养基，放入离心机中离心1500转（调两档），3-4min，观察细胞沉淀情况，如果太少，再次离心3-4min；

4.将离心管拿出，倒掉上清液，在离心管中加入2滴培养液，并用弯头滴管伸入液面以下不断吹打（注意不要将弯头伸出液面，以防有气泡产生，影响细胞生长）；

5.将新的细胞培养瓶中加入两滴管培养液，再将离心管中的细胞转入新的细胞培养瓶（以防加入时产生气泡）并使细胞散步均匀；

6.用酒精擦拭瓶身，显微镜观察细胞形态（有透明的圆的细胞漂浮其中），培养瓶上写明日期及培养细胞的名称；

7.将培养瓶的盖子稍松，放入CO2培养（便于CO2进入）待第二天观察（细胞一般4小时贴壁）；