小鼠骨髓间充质干细胞计数（小鼠间充质干细胞培养）

本文的目的是仔细研究小鼠骨髓间充质干细胞计数和小鼠间充质干细胞培养这两个概念，帮助你理解它们之间的关系。

糖尿病引起的肾脏疾病急性，干细胞如何治疗？

急慢性肾病发病率呈逐年上升趋势，许多难治愈的肾脏疾病发展为终末期肾衰时，传统的治疗方法不能有效缓解肾功能。随着对干细胞研究的逐渐深入，利用干细胞具有自我更新、多向分化潜能和易于转染外源基因等优点，将干细胞应用于治疗肾脏疾病中，分化为肾小管和肾脏实质细胞，参与肾损伤修复，干细胞疗法可能成为肾脏疾病治疗的新措施。

近年来，肾功能不全晚期患者数量呈快速增长趋势，成为世界性医治难题。肾脏移植和透析是传统的基本治疗方法，透析存在着各种并发症，且只是滤过功能的替代，不能完成肾脏的分泌、代谢、维持内环境稳态等一系列重要功能。因此，透析病人的生存质量不高。肾移植是完全的肾脏功能替代，其年死亡率比透析患者低[1]，然而由于肾脏供体短缺、免疫抑制剂的副作用大、手术并发症等因素，使肾移植的开展受到限制[2]。干细胞可形成人体各种组织器官的原始细胞，在肾脏疾病损伤修复方面，干细胞可分化为肾脏细胞并参与肾损伤后的修复和肾脏再生[3]。

1 干细胞的研究背景

干细胞具有自我更新能力和多系分化潜能，根据来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。最早的干细胞研究可追溯到 20 世纪 60 年代，1957 年 Niemann 尝试将正常人的骨髓移植到患者体内，用以治疗造血功能障碍。近年来，诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells）的重大进展进一步将干细胞研究推向了生物医药领域的前沿，使其在医药卫生、科技产业、国防等领域占据重要地位[6]。在临床应用中，造血干细胞、间充质干细胞为医疗新技术，在血液病、自身免疫性疾病、下肢缺血性疾病、糖尿病和神经系统疾病、恶性肿瘤等疾病的治疗上取得了良好效果。

2 干细胞治疗肾脏疾病的机理肾脏的生理功能是由各种肾脏细胞完成的。肾小球的内皮细胞、脏层上皮细胞及肾小球基膜共同构成了肾脏的滤过膜，执行肾脏滤过血浆的功能。肾小管重吸收和分泌功能主要是由肾小管上皮细胞来完成，同时，肾脏中具有内分泌功能的细胞，分泌多种活性物质来调节肾脏的血流和水盐的代谢。肾脏疾病是细胞病变的综合反应，肾脏的各种疾病都与各种肾脏细胞发生结构和功能的改变密切相关，治疗各种肾病最根本的就是恢复肾脏功能细胞的数量和质量[7]。干细胞治疗肾脏疾病可以从细胞水平上通过修复和新生各种肾脏实质细胞，来恢复肾脏的各种生理功能。干细胞治疗肾脏疾病的可能机制为：分化成为肾小球系膜细胞、内皮细胞、足细胞、肾小管上皮细胞等，修复各种肾损伤，促进肾脏分泌，减轻损伤肾脏的炎症反应，为后期肾脏的修复发挥重要作用[8]。

3 干细胞在肾脏疾病治疗中的应用

3.1 干细胞治疗糖尿病应用

干细胞技术制备胰岛细胞，进行细胞移植，成为未来治疗糖尿病的有效方法之一。造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC）移植治疗糖尿病具有良好的临床应用前景。Huang 等[9]在自体骨髓造血干细胞移植（AHST）治疗 Ⅰ型糖尿病方面进行了有益探索，并对国外研究方案进行了改进，延长了病程筛选的界定值，改良了造血干细胞的回输途径，对于病程≥ 2 个月的患者，采用脾动脉或胰动脉插管回输法，增加患者体内局部胰腺组织的干细胞浓度，提高向胰岛细胞的分化率，从而提高了临床效果。

研究人员采用人骨髓间充质干细胞修复糖尿病小鼠受损的胰岛和肾小球损伤，发现人骨髓间充质干细胞能够定位于受损小鼠胰腺和肾脏，改善胰腺 β 细胞功能，促进胰岛素分泌，有效缓解高血糖，在肾脏中部分人骨髓间充质干细胞分化为肾小球上皮细胞，可修复受损肾脏并改善肾功能。

3.2 干细胞治疗肾小球疾病

在肾小球疾病中，肾小球细胞的损害是不可逆的，并可导致慢性肾衰，研究表明干细胞可分化成肾小球系膜细胞，用 MSCs 进行肾小球修复是可行的。细胞疗法改善肾病的关键是 MSCs 归巢到肾小球组织损伤部位，减缓肾小球肾炎的发展，有助于肾小球基底膜更快地修复，包括内皮、间质、上皮和血管系膜，促进肾小球细胞增殖[12]。肾小球外的系膜祖细胞也对肾小球的修复起促进作用。Imasawa 等 [13]证实骨髓来源干细胞可分化为系膜细胞，参与肾小球内皮和系膜细胞更新，并对微血管有修复作用，为肾病的发病机制提供了一个新的视野，表明干细胞疗法有巨大的潜力。

3.3 干细胞治疗遗传性肾病

遗传性进行性肾炎是一种自童年时就显现的遗传性肾脏疾病，其临床特点为血尿、听觉神经性耳聋及进行性肾功能减退，是肾衰竭的第二大遗传病因。传统治疗多采用药物干预、肾脏代替治疗、基因治疗等方式，但相对来讲具有一定的弊端，如药物治疗的长期依赖性及缺少循证医学证据，而肾脏替代治疗通常使移植后发生肾功能不全的几率较高。干细胞具有自我增值能力强、生物学特性稳定等优势，干细胞疗法为现代医学提供了一个新的治疗途径。

3.4 干细胞治疗肾病综合症

肾病变综合症是由多种病因引起的，以肾小球基膜通透性增加伴肾小球滤过率降低等肾小球病变为主的一组综合症。临床具有四大特点：①大量蛋白尿超过 3.5 g/d，可有脂质尿；②低白蛋白血症血清白蛋白小于 30 g/L；③ 高脂血症；④水肿根据不同病因和病理分为 3 类，即原发性肾病综合症、先天性肾病综合症、继发性肾病综合症[16]。干细胞移植治疗肾病综合症可有效防止肾功能恶化，消除蛋白尿、血尿和水肿等临床症状，恢复正常肾功能。 Imai 等[18]采用移植治疗大鼠肾病综合症，外周静脉输注大鼠骨髓间充质干细胞，可有效减少尿蛋白，提高血浆蛋白水平，改善脂质代谢，保护模型鼠肾功能，促进肾脏病理损伤的修复，证实干细胞移植对大鼠肾病综合症具有明显的治疗效果。

利用干细胞来重建受损器官或组织，为再生医学和组织工程的发展打开一扇窗。随着干细胞研究技术和应用水平的不断深入，干细胞向肾脏细胞分化的研究将取得新进展，干细胞移植对肾脏疾病的治疗将会有更广阔的应用前景。

3.5 干细胞治疗肾衰

慢性肾衰（CRF）是由各种原因引起肾脏损害并进行性恶化、造成肾单位严重破坏、肾实质不可逆转的损害，致使机体在排泄代谢废物和调节水、电解质及酸碱平衡等方面发生紊乱的临床综合症，主要的病理表现为肾小球硬化、纤维化、肾小管萎缩、间质纤维组织增生及炎症细胞浸润。急性肾衰（ARF）最主要的病理表现是急性肾小管坏死[19]。Kale 等[20]对缺血再灌注损伤肾模型小鼠进行骨髓干细胞移植，发现移植的骨髓干细胞有肾趋向性，植入损伤的肾脏后可分化为肾小管上皮细胞，改善肾结构和功能，大量坏死的肾小管上皮细胞能够很快被补充，小鼠血浆尿素氮水平降低。肾祖细胞在 ARF 恢复期启动了修复过程，损坏/死亡细胞被清除，干细胞迁移到坏死区，可分化成内皮细胞，为缺血 ARF 小鼠提供早期保护。

利用干细胞来重建受损器官或组织，为再生医学和组织工程的发展打开一扇窗。随着干细胞研究技术和应用水平的不断深入，干细胞向肾脏细胞分化的研究将取得新进展，干细胞移植对肾脏疾病的治疗将会有更广阔的应用前景。

造血干细胞体外集落形成实验

搬运自：知乎 权威的中科博生

目的：验证造血干细胞的 多向分化潜能 。在文献中有用到。doi: 10.1186/s13287-018-0926-x

这些方法虽然均有其局限性而不能完全代表造血干细胞，但在造血干细胞的研究，尤其是人造血干细胞和早期祖细胞的研究中仍具有重要的意义。

目前用来检测造血干细胞和早期祖细胞的体外克隆实验包括长期培养启动细胞(LTC-IC)和延长的长期培养启动细胞(extended long-term culture initiating cell,ELTC-IC)测试、高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential colony form-ing cell, HPP-CFC)测试、卵石样区域形成细胞(cobblestone area-forming cell,CAFC)测试、原始细胞集落(colony forming unit-blast, CFU-Blast)测试、CFU-A(colony forming unit type A)实验、混合集落(colony forming unit-mix,CFU-Mix 或

colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte, CFU-GEMM)培养法及二次再克隆实验(secondary recloning assay)等。中科博生。

（1）长期培养启动细胞和延长的长期培养启动细胞测试

在受照射 骨髓基质细胞 的支持下生长35〜60d所产生的集落被称为长期培养启动细胞(LTC-IC),生长60〜100d的被称为延长的长期培养启动细胞(ELTC-IC) O LTC-IC是反映造血干细胞功能的指标，其原理主要是根据绝大多数祖细胞寿命有限，在长期培养体系中向终末细胞分化而失去集落形成能力，或出现凋亡现象，而具备自我更新能力的细胞则能维系其低分化特性因而长期存活。

迄今为止，ELTC-IC和LTC-IC代表了体外培养中最幼稚的造血细胞。它们从增殖分化到形成集落所需的时间比各种集落形成细胞(包括HPP-CFC、CFU-GEMM,CFU-GM.BFU-E.CFU-E等)要长得多，因而比它们更原始。将这种细胞种植到受照射骨髓基质上能维持数周或数月的造血。用5-FU处理的小鼠骨髓细胞，其中无CFU-S12,有在骨髓基质上启动长期造血的能力，而高度纯化的CFU-S12不能在基质上维持长期造血，这说明LTC-IC是比CFU-S12更早的干细胞。LTC-IC虽然不能代表真正的干细胞，但的确可反映干细胞的存在和变化，这已被大家公认。中科博生。

（2）高增殖潜能集落形成细胞测试

Bradley和Hodgson首先发现，骨1M细胞在多种造血因子存在时能在体外半固体培养10〜12d后形成大集落(直径＞0.5mm，约5X 104个细胞)。他们把骨髓中能形成这种大集落的细胞称为高増殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)。集落培养时间随种属不同而异，小瓯为14d,人为21~28d。中科博生。

HPP-CFC具有如下特点：

①在体内对细胞毒药物5-FU不敏感；

②具有向髄系和淋巴系分化的潜能；

③对多种细胞因子(如GM-CSF, CSF-1、IL-1, IL-3、IL-4, IL-6)有反应性；

④同受致死剂量射线照射小鼠造血的重建密切相关。中科博生。

目前HPP-CFC被分成HPP-CFC-1 x HPP-CFC-2、HPP-CFC-3三群。HPP-CFC-1是高度静息的细胞群，与pre-CFU-S密切相关，通常认为比CFU-A更早，但比LTRC更成熟，相当于第28天的CAFC和MRAo HPP-CFC-2与定向祖细胞更接近，HPP-CFC-3则更成熟。人骨髄晚期HPP-CFC形成宣径约0.5 —1mm的集落，早期HPP-CFC形成直径约1~2mm的集落，有的可达2.5〜5mm。中科博生。

（3）卵石样区域形成细胞测试

CAFC是一种基于Dexter体系的微型基质依赖骨髓培养法，它是将骨髓细胞接种于受致死剂量射线照射的基质细胞层上培养10〜28d,观察卵石样血岛形成情况。CAFC在分化程度上同 MRA 和CFC-Blast及原始 HPP-CFC相当，比LTRC成熟。中科博生。

（4）原始细胞集落实验

CFU-Blast是早期的造血细胞(CFC-Blast)在体外适当的条件下半固体培养18〜32d后，形成的由形态上未分化的细胞组成的小集落(＞25个细胞)。这种形态上未分化的细胞具有高度再克隆能力和自我更新潜能，并有产生多系定向祖细胞的能力，在分化程度上相当于HPP-CFC或更早。中科博生。

（5）CFU-A 实验

这是在体外用半固体培养法检测小鼠骨髓造血干细胞的方法。小鼠骨髓细胞在L929和AF1-19T条件培养液刺激下，在体外培养lid可形成直径＞2mm的集落。人骨髓细胞在CSF-1和GM-CSF存在下培养23d后形成直径＞imm的CFU-AO CFU-A为不均一的细胞群体，在分化程度上，CFU-A比LTRC和HPP-CFC更成熟，较早期的CFU-A相当于HPP-CFC-1。中科博生。

（6）体外混合集落培养

CFU-Mix是半固体培养12〜16d后形成的含有粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核多系血细胞的集落。这些细胞大致相当于较晚期的CFU-S,比LTRC成熟。中科博生。

（7）二次再克隆实验

将造血干细胞先在适宜的条件下进行培养后再检测这些培养后的细胞是否具有集落形成能力。利用该实验通常可以观察造血干细胞的自我复制能力及向祖细胞分化的能力。中科博生。

虽然各种体外实验可以部分反映造血干细胞的情况，但值得注意的是，当前的各种体外检测方法均无法观察造血干细胞向淋巴系的分化，即无法判断这些细胞是否具有全系造血能力，因此，迄今为止仍没有一个体外培养方法可用于检测造血干细胞

动物细胞传代顺序

动物细胞传代培养的操作步骤

1.观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。

2.加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3.打开超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。

4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5.取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6.用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8.将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。

9.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12.擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。

13.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

小鼠骨髓间充质干细胞的细胞大小是多少？

干细胞的培养条件比较高，一定要避免污染！血清要进行支原体检测，自配的培养基要进行污染测试。为了实验自己最好找现成的！可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。厚百提供。

4t1细胞能在c57bl/6小鼠中生长吗

免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞的分裂特点及寿命

研究小鼠骨髓间充质干细胞与中性粒细胞共培养后，中性粒细胞对T细胞免疫的影响，并探索其分子机制，以及共培养诱导后的中性粒细胞对小鼠4T1肿瘤进展的影响。 方法： (1)通过体外分离培养与提纯小鼠骨髓间充质干细胞，骨髓中性粒细胞。 (2)通过体外共培养体系，Annexin-V-PI标记，流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡情况。 (3)体外共培养后中性粒细胞影响T细胞增殖实验：通过Anti-CD3抗体刺激T淋巴细胞增殖，并用CFSE检测其增殖率，同时检测部分T细胞激活

间充质干细胞和肿瘤关系

间充质干细胞和肿瘤关系

间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。

2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘和脐带中的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。

国内间充质干细胞的研究在2015年有了新的突破，北大未名研究及应用的间充质干细胞全器官逆龄抗衰(第四代)价格不到市场价的1/10 。国人可以享受低价高效的顶尖技术，达到全系抗衰、器官修复、器官减龄的目的。

鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。

最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。

然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

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