胚胎干细胞培养基配制（胚胎干细胞培养的注意事项）

在这篇文章中，我们还将讨论胚胎干细胞培养基配制和胚胎干细胞培养的注意事项的技术应用，帮助你解决实际问题。

胚胎干细胞在什么情况下只增殖不不分化

体外培养时，培养基底层用小鼠的成纤维细胞就可以防止胚胎干细胞的分化，尽量减少诱导胚胎干细胞的分化所需因素，。分化即因选择性表达，胚胎干细胞所处的位置，周围的细胞、物质等等都可以诱导分化，体内看似与体外差不多，其实各种分化的调控是体外培养无法达到的， 所以如果要在体外培养时增殖，应该就可以用普通培养细胞的方法即细胞克隆。

具体步骤

一、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制:70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。由胚胎来源的原始(未分化)细胞，它们具有分化成为众多特异细胞类型的潜能。

生物特性

ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠ES细胞的直径7μm～18μm，猪、牛、羊ES细胞的颜色较深，直径12μm～18μm。

ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原（Stagespecificembryonicant，SSEA），而且可以检查到OTC4基因的表达，这两种蛋白是发育全能性的标志。ES细胞中AKP及端粒酶活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。ES细胞的多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。将ES细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形成类胚体。将ES细胞在特定培养基进行培养，可以定向分化成特定组织，如ES细胞在含有白血病抑制因子（LIF）和维生素A酸（RA）的培养基上，可以分化形成全壁内胚层，将ES细胞与胚胎细胞共培养或将ES细胞注入囊胚腔中，ES细胞就会参与多种组织的发育。

应用前景

生产克隆动物：ES细胞从理论上讲可以无限传代和增殖而不失去其正常的二倍体基因型和表现型，以其作为核供体进行核移植后，在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体，ES细胞与胚胎进行嵌合克隆动物，可解决哺乳动物远缘杂交的困难问题，生产珍贵的动物新种。亦可使用该项技术进行异种动物克隆，对于保护珍稀野生动物有着重要意义。

生产转基因动物：用ES细胞生产转基因动物，可打破物种的界限，突破亲缘关系的限制，加快动物群体遗传变异程度，可以进行定向变异和育种。利用同源重组技术对ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种；利用ES细胞技术，可在细胞水平上对胚胎进行早期选择，这样可以提高选样的准确性，缩短育种时间。

用于器官组织移植：作为一种被称之为“种子细胞”的ES细胞，为临床的组织器官移植提供大量材料。人ES细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。

治疗人类胚胎干细胞群：细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。ES细胞经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。以ES细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意的转基因ES细胞系，为克服基因治疗中导入基因的整合和表达难以控制，以及用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代开辟了新的途径。

实验室小白篇：细胞培养用的液体

一、细胞培养所需的培养液

在细胞的研究和利用过程中，最主要的是要为细胞提供最适的生长条件，保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规，而且细胞培养，试剂昂贵，费时、费力，不是随随便便就可以进行的。

细胞只有在最适生长条件下，才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣，就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长，都不是最适生长条件。

二、平衡盐溶液

平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用，同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液（简称PBS) 。

三、血清

血清中含有丰富的营养成分，包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多，包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。

选择一批最适于细胞的血清是很重要的，而且如有可能的话，应要求购买来源公司保留足量，以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后，以低密度（直径6mm 的平皿中加入约103个细胞）接种5~6 个平皿， 其中一个平皿中加入含30％血清的培养液，以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后，出现肉眼可见的克隆时，倒掉培养液， 2％亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。

四、抗生素

一般细胞培养时，抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素，如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml ,链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍， 分装为小包装， 于－20℃条件下保存。一次用一个小包装， 避免反复冻融 。

五、特殊的添加因子

特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适当提高，应尽可能用营养丰富的培养液，如使用胎牛血清。这些都属于一般优化条件。细胞培养条件优化的原则是：根据细胞类型， 模拟体内环境， 添加不同的细胞生长因子及有利于细胞生存、增殖的添加剂。表1 是常用的细胞培养添加成分。

表 1 常用的细胞培养添加成分

一种细胞生长因子常常是多种细胞的丝裂原，如碱性FGF, 不仅是成纤维细胞的丝裂原，还是内皮细胞、角质细胞、黑素瘤细胞的丝裂原。EGF 可促进上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞及平滑肌细胞等多种细胞的增殖。

培养干细胞时，常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ，又称分化抑制因子( DIA )， 是一种分泌型多肽，可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般，可用纯化的LIF 直接加到培养液中，或使用用LIF表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他一些促干细胞生长的因子。目前，多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便，与STO 细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml 。

体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上，添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液，且有商品供应，如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。

六、消化液

细胞生长至一定密度时，需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面，离散成单个细胞。常用的消化液是0.25%、0.125％的胰蛋白酶和0.02％的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液，以无钙镁的PBS 或Hanks溶液配制。它们可单独使用，也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白／0.02%EDTA混合液。有些上皮细胞贴壁力强，需较高浓度的胰蛋白酶(0.25%）或延长消化时间，甚至需要37°C温育。如果温育较长时间（超过20min)细胞仍不能脱壁，则应采取分步消化的措施，即将已脱壁细胞移出至离心管，加完全培养液中和胰蛋白酶的作用，对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。

七、细胞培养用的其他液体

细胞培养时，还会用到其他一些液体，如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液，以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。

谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，会导致细胞因生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故要适时添加。可配制200倍液体－20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培养液内，终浓度为2mmoVL 。

HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入，可明显改善细胞状态。通常配制200倍液，-20℃ 冰箱保存，在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。

另外， 2－巯基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清， 有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA) 对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。也开始用于一些难以培养的细胞。常用终浓度为5×10-5mol/L。常配制成0.1mol/L 的储存液，用时每升培养液加0.5ml 。

培养全能干细胞的培养基是什么，为什么

培养全能干细胞的培养基是什么

动物细胞培养液：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清或血浆.

植物组织培养液的成分：水、无机盐、蔗糖、植物激素（生长素,细胞分裂素）等.

干细胞对培养条件要求较高,常用的胚胎肝细胞培养基有mTeSR

1培养基,主要成分有：DMEM、bFGF,EGF、血清、双抗、LIF、谷氨酰胺、二巯基乙醇、非必需氨基酸等。

干细胞相关的培养液都必须在5％CO2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。

高中，生物，胚胎干细胞的培养

肯定不是。

饲养层是一层细胞，用于提供干细胞培养所需的物质（教材中说的很清楚）。

细胞培养液的成分有：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清或血浆.

干细胞相关的培养液都必须在5％CO2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。

ES培养基成分

不同的ES配方多少有些差异.基础培养基一般用DMEM或DF12.（以下为DMEM培养基为例）

1、提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻;

2、在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸钠、抗生素等)，按照比例加入dmem培养基中，作好标签;放入4℃冰箱保存。

ES细胞培养方法：

化冻

将血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存;

灭活

(1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准);

(2) 当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短(比如：不超过5分钟)，则仍可使用;若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME

胞的培养;

(2) 取出，自然冷却至室温(约需1-3小时)，可分装或-20℃继续冻存;

分装

(1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡;如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;

(2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1.取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死;

2.将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中;

3. 把平皿转入超净台;

4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次;

6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);

7. 加入适量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520，下同)，体积约等于组织块体积;

8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘)，加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀(5-10次)，静置;

9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。

10. 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);

11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签(ME-0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好)，转入培养箱培养;

12. 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)，若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代(视细胞疏密而定)，放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞(Feeder)的制备

注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)

弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

放入培养箱培养3小时(2-4小时);

用0.1% 明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;

弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);

加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。

ES细胞的复苏

提前制备好相应数量的Feeder;

准备37-39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞)，迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;

转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟;

弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿)，补加适量培养液;

转入培养箱培养，次日换液;此后每24小时换一次液，每48小时传一次代(视生长情况)。

ES细胞的换液

1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内)；

2.细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察(判断生长情况，并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;

3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基);

4. 放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;

提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内);

将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少;

将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去;再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打(视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来)，滴加补加培养基至5 ml左右(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右)，作好标签;

前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。

ES细胞的冻存

常规方法将细胞消化成单细胞悬液;

转入试管，1000转/分钟离心5分钟;

配适量冻存液(为含10% 二甲亚砜(DMSO)，10% FBS的DMEM培养液);

弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可)，转入冻存管，作好标签;

放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。

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