人脐带间充质干细胞培养基配置（脐带间充质干细胞培养方法）

充质干细胞 2023年03月25日 15:22 im

通过这份文件，我们希望为你提供有用人脐带间充质干细胞培养基配置的知识，有效解决你目前面临的问题。

脐带间充质干细胞能治疗葡萄糖磷酸异构酶缺乏症吗？

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。

什么是间充质干细胞？

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，它来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞。

主要用途包括：

能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；

能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；

能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。

能在体内或体外通过生物因子定向诱导分化为神经细胞、胰岛素分泌细胞等，从而为帕金森、糖尿病等治疗提供新的治疗方式，是目前干细胞研究的热点之一。

是否该储存脐带间充质干细胞

人体内的间充质干细胞在出生时达到峰值，而后随着年龄的增长而绝对减少。在这种情况下，很多人选择在孩子出生的时候存储脐带间充质干细胞，因为它不仅活性强，并且数量丰富。实验证明，一根脐带提取的间充质干细胞的数量相当于成人5000毫升骨髓中的间充质干细胞数量,且质量更优活性更强。

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充质干细胞成脂诱导分化培养基的配制

诱导液？你说的是成骨诱导条件培养基吧。

5天后半量换液，第10天当观察到少量细胞变为梭形、贴壁，即全量换液，改为条件培养基。此后每3-4天换1次条件培养基。倒置显微镜隔日观察，直至细胞不能传代、衰老死亡为止。

下面就是爬片的制作，染色以及结果判定了。

诱导培养基添加必要的成分使组织切块或细胞形成愈伤组织,分化培养基指把促使愈伤组织细胞恢复全能性,可以进行正常的根茎叶的形成

求助人脐带间充质干细胞提取方法

方法:

无菌条件下截取流产胎儿双侧四肢骨,PBS冲洗髓腔,离心去脂肪及上清液,L-DMEM重悬细胞,沿管壁缓慢滴加至底部有等量1.073 g/mL Percoll分离液的离心管中,离心后吸取中间界面白膜层,加入含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素钠、链霉素的L-DMEM完全培养基,接种后置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内培养.48 h后换液,去除未贴壁细胞,以后每2d换液一次.待细胞达到80%～90%融合时,胰酶-EDTA消化传代.

主要观察指标:

倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞技术检测其表面标记物;碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成软骨分化能力.结果:原代及传代培养的胎儿骨髓间充质干细胞呈梭形外观,具有较强的增殖能力.胞体较小,细胞核/浆比例大,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆少,染色质较疏松,表现出早期细胞的特点,传至第20代细胞超微结构仍无明显改变.细胞表面抗原CD29,CD44,CD105呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达.骨髓间充质干细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原均呈阳性.

结论:

利用密度梯度离心+贴壁筛选法可成功分离培养胎儿骨髓间充质干细胞,所获细胞能够向成骨细胞及软骨细胞分化,该方法为体外培养扩增胎儿骨髓间充质干细胞的简单、稳定、高效的手段.

HUVEC人脐静脉内皮细胞培养要点

1984年，HUVEC细胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace L.Mckeehan从一段长约10-20cm的人正常脐带静脉中获取、建立。

SetsukoShioda等人研究发现，HUVEC细胞株18-30代的倍增时间为23.5个小时，24-27代的倍增时间为67个小时，27-30代的倍增时间为84个小时，32-34代的倍增时间为100个小时。培养至40代后，细胞形态出现多样化，有些细胞变大或变小，有些细胞出现多核；细胞密度下降、倍增时间延长。最后细胞在第54代停止生长，ATCC的预期寿命也显示在50-60代。

2018年，Setsuko Shioda等人发现HUVEC细胞株（passage 31）在贴壁汇合时细胞与细胞之间存在间隙，这与典型的内皮细胞特征有所不同。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4 mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm器皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞冻存

冻存条件

60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO，液氮储存

【推荐海星HyCyte™一步冻存液(即用型、无血清、无需程序降温)】

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×106个/mL。

注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

培养基：内皮细胞培养基础培养基＋5% FBS＋1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S

推荐传代比例： 1:3-1:4，每2-3天换液一次

培养条件：气相：95%空气+5%CO₂，温度：37℃

细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1. 预热完全培养基、胰酶、PBS

2. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

3. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA 货号: GUTP-R001）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

4. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

5. 将细胞悬液按1：2到1：4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

1. 该细胞为有限传代细胞系，在体外培养可传20代。请注意代次控制。

2. 该细胞培养难度较高，建议使用专用培养基。

3. 永生化的人脐静脉内皮培养体系：内皮细胞基础培养基＋5% FBS＋1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S。

推荐使用海星人脐静脉内皮细胞完全培养基，货号：TCH-G406。

4. 如选择使用其它品牌培养基，可选：

（1）内皮细胞基础培养基推荐：ScienCell（Cat.No.1001）

基本成分介绍：永生化的人脐静脉内皮培养体系是专门为血管内皮细胞体外培养设计的最适于其生长的完全培养基。包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基的配方能够选择性的促进正常血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。

（2）胎牛血清推荐：HyCyte™干细胞预筛选胎牛血清（Cat.No.FBP-S001）

基本成分介绍：适用于有较高要求的细胞和较难获得的细胞，如血管内皮细胞。

（3）内皮细胞培养添加剂推荐：ScienCell（Cat.No.SC1052)

基本成分介绍：内皮细胞培养添加剂(ECGS)是一种从牛脑垂体提取的培养基补充剂，含有培养血管内皮细胞所必需的生长因子、激素和蛋白质。该补充剂最大限度地促进永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生长，该因子的添加对维持永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形态至关重要。

（1）请务必使用以上两种推荐培养体系进行永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养，否则可能导致细胞无法增殖。

（2）T25瓶细胞由于运输过程影响细胞会分泌产生的少量小黑点，不是污染问题，属正常现象，使用专用培养体系进行培养后黑点会逐步减少。

（3）永生化的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）对血清的品质要求较高，请使用高品质胎牛血清进行培养。如细胞状态欠佳，建议将胎牛血清的浓度提高到10%。

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