解放军总医院干细胞研究（解放军总医院301医院干细胞研究中心）

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文献解读 | 单细胞测序揭示早期人类胚胎骨骼干细胞起源

为探究早期人类胚胎骨骼干细胞起源，同济大学联合解放军总医院第五医学中心和北京放射医学研究所进行了相关研究，相应成果发表 Cell Research 杂志。该研究利用10x Genomics单细胞转录组测序绘制了早期人类胚胎肢芽、长骨和颅骨的发育图谱，并结合体内外功能验证发现了一群定位于软骨外膜，具有自我更新和分化为软骨与成骨细胞潜能的胚胎骨骼干祖细胞（eSSPC），对于深入理解人类骨骼发育及损伤修复机制具有重要意义。

接下来我带大家一起走进这篇文章

通过单细胞转录组和功能分析来剖析人类胚胎骨骼干细胞的个体发育

Dissecting human embryonicskeletal stem cell ontogeny by single-cell transcriptomic and functionalanalyses

【发表杂志】 Cell Research （IF：25.617）；

【发表时间】 2021年3月；

【应用技术】 10x Genomics单细胞转录组测序；

研究流程

骨骼的发生发育在小鼠、小鸡和蝾螈等生物中已经得到了广泛的研究，而人类的研究主要停留在组织形态学水平。本研究首先对孕5周人类胚胎肢芽和孕8周人类胚胎长骨进行高通量单细胞转录组测序，分别分析肢芽和长骨的发育谱系，然后再结合流式细胞术等实验鉴定胚胎骨骼祖细胞（eSSPC）的表型标记（PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+），最后在颅骨样本中发现了一群具有同样表型的细胞，说明其可能在膜内成骨和颅骨发育过程中发挥关键作用。

研究背景

先前的研究表明自我更新的骨骼干细胞（SSCs）存在于高等脊椎动物和早期发育阶段。SSCs是一群能够自我更新并分化产生软骨细胞、成骨细胞和基质细胞的组织特异性干细胞，在骨骼发育和损伤修复过程中发挥关键作用。人类胚胎SSCs在早期骨骼形成中的个体发生仍然是未知的。在脊椎动物中，附肢骨骼的最早祖细胞是在肢芽中形成的。虽然在小鼠和鸡肢芽中发现了不同的间充质祖细胞，但人类肢芽中的细胞异质性和谱系层次尚不清楚。

总之，关于人类胚胎骨骼发生的单细胞转录组测序研究仍然缺乏。在本研究中，通过10x Genomics单细胞转录组测序生成了第一个全面的人类胚胎骨骼发生细胞图谱。通过系统地检查多个骨骼部位的细胞异质性和谱系层次，本研究在人类胚胎长骨和颅骨中发现了不同的骨骼干/祖细胞。

主要结果

1. 整体分析肢芽和长骨发育过程中单细胞转录组

本研究对上肢和下肢芽（5个Weeks Post Conception，WPC），以及前肢和后肢长骨（8WPC）进行解剖并接受酶消化。流式分选后，进行10x Genomics单细胞转录组测序（图1b） ，最终在5WPC肢芽中获得19,890个单细胞，在8WPC长骨中获得15,680个单细胞。对肢芽和长骨样本的综合分析发现了16个亚群（图1c）。

PRRX1+肢芽间充质亚群和EPCAM+上皮细胞亚群主要存在孕5周样本。RUNX2+骨祖细胞、OSR2+NOV+软骨膜间充质基质细胞、SOX9+成软骨细胞和软骨细胞、MYOG+肌细胞以及SOX10+施旺细胞主要在孕8周样本中检测到。成骨软骨前体细胞（cluster4，OCP）平均分布于肢芽和长骨样本之间，提示最早的骨骼干祖细胞可能包含于其中（图1c-e）。

Pearson相关分析明确区分了成骨亚群和非成骨亚群。RNA velocity伪时间分析显示，肢芽间充质祖细胞向OCPs分化连续，随后细胞命运分化成成骨和软骨谱系（图1f）。PAGA分析显示，OCPs在连接肢体芽间充质祖细胞（PRRX1+）到胚胎长骨中的PMSC/软骨母细胞/软骨细胞（SOX9+）和骨祖细胞（RUNX2+）中发挥了关键作用（图1g）。

2. 肢芽发育过程中的间充质细胞谱系

在5WPC人类肢芽中识别出10个亚群（图2a）。4个间叶细胞亚群的层次聚类分析显示，LBM1（cluster 1）与LBM2（cluster2）聚类，而LBM3（cluster 3）和OCP（cluster4）聚类在一起（图2b）。在两个上皮细胞亚群中（图2a），只有cluster 9（对应上皮细胞1，图1c,d）高表达AER标志物FGF8，这与之前在小鼠胚胎中的研究一致。PAGA分析显示LBM2和上皮亚群之间存在很强的相关性（图2c）。细胞周期分析显示，LBM2相比其他间质亚群具有更强的增殖能力。GO分析显示，LBM2富含调控代谢过程的基因，而LBM3和OCP富含参与胚胎骨骼发育和骨化的基因。

本研究分析了最近发表的小鼠肢芽（E11.5）单细胞转录组测序数据集发现，除了LBM2和上皮（非AER亚群）亚群在小鼠肢芽中未被预测外，大多数人类亚群在小鼠中是保守的。缺乏高度增殖的LBM2亚群暗示E11.5小鼠肢芽提前成熟。小鼠OCP亚群高表达 SOX9 ，提示早期软骨分化。综上所述，与人类相比，这些数据揭示了人体肢芽间充质和上皮细胞的细胞异质性和物种特异性。

3. 长骨发育过程中的软骨谱系

由于5WPC人肢芽未开始成骨，本研究继续分析8WPC长骨，以寻找人类胚胎SSCs。骨软骨细胞系（OCLCs）分为7个亚群（图3a）。胚胎长骨OCP细胞进一步分群鉴定得到3群干祖细胞，GO分析显示，与干细胞增殖相关的基因在cluster3中富集（图3b），提示其可能含有胚胎骨骼干细胞/祖细胞（eSSPC）。拟时序分析显示从eSSPC到骨祖细胞、成软骨细胞/软骨细胞和软骨膜间充质基质细胞（PMSC）亚群的强定向流（图3c）。转录调控网络分析发现eSSPC富集了转录因子FOXP1/2（图3f）。免疫荧光染色显示FOXP1/2+细胞主要定位于软骨外膜和新生的初级骨化中心内部。连续性克隆传代以及体内外分化实验证明eSSPC具有自我更新和成骨、成软骨分化潜能，它有可能调节长骨发育和初级骨化中心（POC）的形成。

4. CADM1作为胚胎骨骼祖干细胞（eSSPC）表型标记的鉴定

为了分离eSSPC用于体外功能研究，研究者首先筛选长骨软骨细胞系OCLC亚群间差异表达的细胞表面标记物。发现细胞粘附分子CADM1在eSSPC中优先表达（图4a）。CADM1也在施旺细胞中表达，免疫荧光显示CADM1分布于软骨膜和初级骨化中心（POC）（图4b）。在转录平均细胞评分（TACS）分析中显示，在软骨细胞OCLC亚群中富集PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+细胞可进一步提高eSSPC的纯度。用流式细胞仪对eSSPC进行单细胞转录组测序分析排序PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+细胞。聚类分析发现两个不同的亚群，包括93.3%的eSSPC表达 FOXP1 、 FOXP2 和 GAS2 , 6.7%和施旺细胞表达 SOX2 、 SOX10 和 MPZ 。相似度分析也证实eSSPC是PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+高度富集细胞。

研究者进一步检测eSSPCs的自我更新和分化潜能，发现PDGFRAlow/-PDPN+CADM1+细胞可以分化为成骨和软骨。PDGFRAlow/-PDPN+CADM1-细胞仅发生成骨分化。

5. 颅骨发育过程中的成骨谱系发展

为了测试在胚胎颅骨中是否存在类似的骨骼干细胞，研究者在2个8WPC人颅骨中进行了单细胞转录组测序分析，发现了一群同样具有PDGFRAlow/-PDPNCADM1+表型的神经脊来源细胞（Neural crestderived cells, NCDCs）在颅缝和软骨膜内富集，暗示其可能在膜内成骨和颅骨发育过程中发挥关键作用。

研究结论

人类骨骼干细胞（SSCs）已经在胎儿和成人的长骨中被发现。然而，人类胚胎SSCs在早期骨骼发生过程中的时空个体发生尚不清楚。在这里，本研究以单细胞分辨率绘制了人类肢体芽和胚胎长骨的转录景观，以解决这个基本问题。本研究发现在人肢芽间叶和上皮内存在显著的异质性，并利用已知的标记基因将它们沿着近端远端和前后轴排列。骨-软骨形成的祖细胞最早出现在核心肢芽间充质中，在胚胎长骨进行软骨内成骨过程中，这些祖细胞产生了多个群体的干细胞/祖细胞。重要的是，本研究发现了一个软骨膜胚胎骨骼干/祖细胞（eSSPC）亚群，它可以自我更新并生成骨软骨细胞系，但不能生成脂肪细胞或造血间质。eSSPC以粘附分子CADM1为标记，与FOXP1/2转录网络高度富集。有趣的是，在人类胚胎颅骨的矢状缝中也发现了具有相似表型标记和转录网络的神经嵴衍生细胞。综上所述，本研究揭示了人类胚胎骨骼发生过程中的细胞异质性和谱系层次，并识别出独特的骨骼干/祖细胞，它们协调软骨内和膜内骨化。

参考文献

He J,Yan J, Wang J, et al. Dissecting human embryonic skeletal stem cell ontogeny bysingle-cell transcriptomic and functional analyses. Cell Res . 2021; 31(7): 742-757.

李超   | 文案

2022年解放军总医院第七医学中心博士后站招生简章

一、报名条件

(一)政治立场坚定，拥护中国共产党的路线方针政策，遵纪守法，品德优良，学风端正。

(二)年龄应当在35周岁以下，且获得博士学位一般不超过3年。

(三)具有较强的研究能力和敬业精神，能够开创性地完成相应科研工作。

(四)必须具备完全脱产在我中心从事博士后研究工作的条件，不得兼职从事博士后研究工作。

二、相关待遇：

1、薪酬

工资发放对象为统招统分或已同原单位解除劳动关系的地方博士后，基本工资和五险一金等福利参照中心聘用人员薪酬待遇实施办法。现役军人(武警)博士后、军队转业以自主择业方式安置的博士后以及定向培养的地方博士后均为带薪培养，中心不再另行发放工资。

2、绩效津贴

军队博士后人员绩效按照军队相关规定办理;地方博士后人员按照中心聘用人员绩效分配范围分配科室绩效津贴。

3、科研经费

博士后可申请中国博士后基金面上项目(一等资助12万元，二等资助8万元)、特别资助项目(18万元)和站前资助项目(18万元)。中心对获得中国博士后基金资助的博士后视情给予相应匹配。

4、住房保障

按照军队住房管理政策，将符合规定条件的在站博士后研究人员纳入住房保障范围，为在站博士后研究人员安排公寓住房，确无保障条件安排公寓住房的，参照培养单位相同资历现役干部标准发放租房补助费。在研究工作期满两年的下一个月起，不再纳入住房保障范围。在京已分配住房的军队博士后人员，不再提供住房保障。

5、职称评定

地方博士后期满出站前，可按解放军总医院职称评审相关规定，参加医院组织的高级职称评定。

三、申请程序

拟进站做博士后研究工作的申请者根据本人所学专业和意愿，与合作导师联系，达成初步意向，由导师指导完成详细申请程序。

四、招生计划

2021年度第七医学中心博士后站导师招生计划

1、封志纯 主任医师

儿科学儿童重症专业。研究方向为儿童重症遗传学基础与临床：新生儿/儿童脓毒症发生的遗传免疫学及临床防治。遗传代谢病胎儿/新生儿期诊断和处置。新生儿/儿童体外生命支持的出凝血管理。

招收人数：3人

联系人：高 铭

电话：010-66721838

邮箱：bayizhaopin@163.com

2、邹丽萍 主任医师、教授

儿科专业 主要研究新一代测序技术在复杂性疾病遗传机制的应用研究;出生缺陷防控相关筛查诊断技术、产品的研发与应用研究;遗传性疾病新发基因及突变的功能研究;新一代测序结果新异常基因的组学功能验证研究;出生缺陷的环境与遗传相互作用、机理和防治技术;孤独症病因诊断和防治研究。

招收人数：3人

联系人：高 铭

电话：010-66721838

邮箱：bayizhaopin@163.com

3、周辉霞 主任医师

小儿泌尿外科。主要研究腹腔镜和机器人辅助腹腔镜技术在儿童泌尿系统复杂先天畸形类疾病中的应用;研究结构畸形类疾病的的发病因素和致病机制，探索具有筛查、诊断作用的分子标志物、基因变异等多组学指标，开展多模态数据分析利用;研究儿童泌尿系统肿瘤发生发展的表观遗传学和免疫调控机制。

招收人数：1人

联系人：高 铭

电话：010-66721838

邮箱：bayizhaopin@163.com

4、李秋平 主任医师

新生儿科专业。主要研究早产儿发育性疾病中的损伤与修复机制，及早产儿视网膜病(ROP)、支气管肺发育不良(BPD)等的基因与干细胞治疗。

招收人数：2人

联系人：高 铭

电话：010-66721838

邮箱：bayizhaopin@163.com

5、孟元光 主任医师

妇产学专业 ，主要研究妇科恶性肿瘤的临床与基础研究、子宫内膜异位症的临床与基础研究。

招收人数：2人

联系人：王铭洋

电话：13520207461

邮箱：My_wang616@163.com

6、尚丽新 主任医师

产科学专业 ，主要研究围产医学。

招收人数：2人

联系人：王 晶

电话：13141307059

邮箱：13141307059@163.com

7、杨蓉娅 主任医师

皮肤病学专业 ， 主要研究真菌感染性皮肤病;皮肤损伤修复。

招收人数：3人

联系人：杨蓉娅

电话：13910286262

邮箱：yangrya@sina.com

8、盛剑秋 主任医师

消化内科学专业 ，主要研究消化道早癌及消化系统疾病内镜微创诊治新技术研究;大肠癌及遗传性大肠癌筛查、预防和发病机制研究;炎症性肠病的基础与临床研究。

招收人数：2人

联系人：周 畅

电话：13501285927

邮箱：13501285927@163.com

9、孙天胜 主任医师

骨科学专业， 主要研究脊柱脊髓损伤、损伤控制骨科学。

招收人数：2人

联系人：孙天胜

电话：13501072165

邮箱：suntiansheng-@163.com

10、戴宜武 主任医师

神经外科学专业 ，主要研究神经损伤修复与干细胞移植研究;神经胶质瘤分子诊断与靶向治疗研究。

招收人数：2人

联系人：戴宜武

电话：15910526388

邮箱：dddyyywww@163.com

11、黄勇华 主任医师

神经内科学专业 ，主要研究脑小血管病。

招收人数：2人

联系人：黄勇华

电话：13810338513

邮箱：huangyh@163.com

中国干细胞抗衰老机构

个人在细胞行业里待了很多年了，也参观过很多医院、实验室和细胞机构，总结出三个公认的标准，仅供参考。

1）基础资质：看是否有行业资质

干细胞行业有两个资质，细胞库、制备中心，属于政府批复资质，有这两种资质的，相对正规；

2）临床实力与潜力：看是否与国内排名靠前的三级甲等医院在合作

看是否与北京协和医院、四川大学华西医院、中国人民解放军总医院等排名前几的三级甲等医院在合作，与这些机构合作的机构眼光相对会长远一些。

3）重点！是否通过中检院（中国食品药品检定研究院）检测

中检院是国家机构，目前干细胞临床都要经过中检院检测，有中检院检测质量才有保障。

在所有的干细胞机构中，成都康景生物给我印象最深，上面3个标准都达到了，而且扎实在做干细胞，可以推荐▪⋅

我国干细胞研究领域的专家有那些？

徐尚，细胞学教授，博士生导师。秦皇岛吉泰生物科技研究所所长、研究室主任、技术总监。中国最早从事干细胞研究的专家之一，主持干细胞在脑神经损伤，糖尿病、亚健康等病种的临床应用研究达十余年，积累了丰富的临床经验，特别是对疑难杂症的诊断和治疗有很深的造诣。在我国干细胞领域最早研究干细胞在肾衰、重症尿毒症中的临床应用及肾脏塑型课题并取得了重大进展，研究并掌握的领先核心技术使干细胞成倍植活，为我国干细胞事业和生命科学的研究做出了重大贡献。

基因敲除实现造血干细胞稳定重建

近日，解放军总医院第五医学中心造血干细胞移植科与北京大学、北京友安医院合作，艾滋病白血病患者基因编辑成人造血干细胞移植研究取得重要进展：建立了ccr5基因编辑技术体系，实现了基因编辑后的成人造血干细胞移植。人体造血干细胞长期稳定的造血系统重建为后续基因编辑治疗的安全性和有效性奠定了基础。相关研究成果最近发表在《国际医学杂志》、《新英格兰医学杂志》上。

2007年，柏林白血病患者接受了CCR5-DELTA32突变的造血干细胞移植，血清中的HIV病毒得到有效清除，实现了艾滋病的“功能治愈”。

解放军总医院第五医学中心陈虎、胡良奈、张斌等专家团队与北京大学密切合作，共同开发了crispr基因编辑造血干细胞技术。在前期实验研究的基础上，他们选择了一名艾滋病白血病患者，在中华骨髓库中找到了合适的健康供体。在体外使用crispr技术后，他们将正常临牀供体造血干细胞中的ccr5基因敲除。在造血干细胞移植科胡良甲教授的共同努力下，他们实现了临牀供体造血干细胞ccr5基因的敲除。从基因编辑供体获得的cd34+成人造血干细胞成功移植到患者体内。移植后4周患者病情完全缓解，供者型细胞嵌合率达100%。经过19个月的随访，患者的白血病处于持续完全缓解状态。病人的造血系统恢复了。经基因编辑的成体造血干细胞能在人体内长期稳定存在，无靶向丢失等副作用。

专家指出，本研究将进一步提高基因编辑效率或优化移植方案，有望加速基因编辑造血干细胞移植技术向临牀疾病治疗的转化。

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