间充质干细胞培养步骤（间充质干细胞的培养流程）

本文的目的是加深你对间充质干细胞培养步骤和间充质干细胞的培养流程的认识，以帮助你理解它们的关系。

如何才能培养出好的间充质干细胞

MSCs在密度过高的情况下会老化，细胞体积会增大，CD105降低，所以原代细胞不可等到密度过大的时候传代，融合度达到50~60%时弃除组织块。密切观察细胞等融合度大概能达到70%左右，进行传代，传代密度不可过高或过低，过高或过低都会影响细胞的干性和贴壁能力。 廊坊康宝汇泰就是干这个的，有兴趣可以一起去参观一下。

间充质干细胞预处理最新方法

间充质干细胞预处理最新方法如下。

1、在间充质干细胞在细胞收获前1220h，向培养基中加入TNF因子、IL因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐进行诱导处理。

2、将诱导完成的间充质干细胞用胰蛋白酶进行消化，然后终止消化，离心，收集沉淀，对沉淀进行重悬，清洗，最后保存。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常 重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术

  一、实验前准备 

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

1. 选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。

3. 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

 二、全骨髓提取  

1. 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

2. 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

3. 用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

  三、细胞制备

吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。

 四、接种培养  

1. 离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm

2. 培养瓶中，轻轻摇匀;置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2饱和湿度培养箱中培养。

3. 24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。

  五、细胞传代

待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

本实验以 1：2 进行传代。

  六、细胞观察 　

细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。

从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。

  七、注意事项   

1. 缓慢冲洗骨髓腔：

冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。

2. 严格无菌：

取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作

3. 培养基中血清浓度：

过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养

4. 原代细胞静置培养：

原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。

间充质干细胞移植都有哪些方式

间充质干细胞移植，指的是将间充质干细胞从自身采集，然后进行培养、纯化，再回输进患者体内用以治疗硬皮病、皮肌炎、红斑狼疮、类风湿、运动神经元病等免疫性疾病的一种最前沿的治疗方法。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为肾、脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于病变引起的组织器官损伤修复。

诺莱医学临床提示间充质干细胞的移植分为以下四个部分

第一步：对患者的整体状况进行评估，如果没有禁忌症如：感染、肾危象、心包大量积液等的情况下，进行细胞动员4－5天。

第二步：MSCs的采集（骨髓、脐带、脂肪和羊膜）

第三步：MSCs的分离、培养及扩增,大约20天左右

第四步：MSCs的移植:

1.静脉注射

2013年5月-2014 年4月，朱宁等人在诊治18例系统性红斑狼疮患者时，用分离培养后的间充质干细胞采用干细胞移植技术进行治疗。该干细胞移植治疗就是采用静脉输注的方式，移植方法如下：患者取仰卧位，首先取肘前部较粗血管，利用生理盐水建立静脉通道，然后将已复温好的装有间充质干细胞的干细胞袋接入静脉通道内，覆盖无菌纱布于穿刺部位，并注意控制滴速，一般干细胞悬液 30 ml于 2 小时内滴完，最后滴入生理盐水100 ml 以冲洗管道。为入选患者均完成1个疗程的治疗。结果证明应间充质移植治疗系统性红斑狼疮疗效肯定，且较为安全。

2.动脉注射

干细胞移植治疗糖尿病，是糖尿病治疗新疗法中的热门疗法，隆敏等人曾经用间充质干细胞移植方法治疗一位39岁的Ⅰ型糖尿病女性患者。移植过程为：患者进入手术室，寻找到供应胰腺的胰背动脉后，将间充质干细胞缓慢均匀注射入胰背动脉。结果该患者术后3个月内胰岛素剂量大幅度减少了58.54％，有望完全停用胰岛素。

3.多点混合移植

干细胞移植治疗糖尿病足的疗效被广泛认可，在众多临床案例中，部分研究采用混合移植的方式以求使干细胞在体内发挥的功效更加全面化。虞朝黎等人用间充质干细胞移植治疗17例缺血性糖尿病足患者，移植方法就是采用多点混合注射的方法，具体过程为：抽取间充质干细胞后分离，配成细胞混悬液；在手术室硬膜外麻醉后，无菌条件下，将干细胞悬液按3×75px间距进行肌肉注射，病变严重的按1×25px间距注射；肌肉注射的同时进行股动脉穿刺，放置导管，将部分干细胞悬液注入股动脉。

4.病灶部位注射

2007年至2011年王玉龙等人采用间充质干细胞移植治疗胫骨骨折骨不连患者11例，结果患者经间充质干细胞移植治疗胫骨骨折骨不连，在4-27个月，平均13个月中，X线片显示骨折愈合良好，疗效满意，有临床应用价值。移植方法为：在手术室X 线透视定位下，用14号骨穿针准确刺入胫骨骨不连部位,完全注入间充质干细胞悬浮液。此外，在应用间充质干细胞治疗小儿脑瘫的研究中，很多研究者也会选择患儿脑内移植、腰椎穿刺等与疾病相关的功能组织位点进行移植。

诺莱医学温馨提示：

①MSC在组织中的含量（细胞丰度）：脐带的含量毫无疑问为最高，羊膜和脂肪次之；而脐带血中含量极少，导致检测不到之事常用发生；

②MSC增殖能力：优于MSC具有年龄特性，脐带和羊膜来源的MSC具有明显的优势，脂肪和骨髓次之；

③免疫调节能力：脐带、羊膜和脂肪来源的MSC优于骨髓MSC，而胎盘MSC的免疫调节能力最差；

④分泌细胞因子谱：脐带MSC分泌细胞生长因子的总量明显高于骨髓MSC，但是不同来源的分泌细胞因子谱有明显的特点；

⑤由于具有来源获取方便和高增殖能力等特性，能培养获得大量的MSC细胞数足够满足临床治疗需要，使得脐带、羊膜和脂肪最适合作为MSC细胞治疗的组织来源。但是我们也必须认识到，不同的实验室、不同的分离方法及不同的培养体系，均可导致MSC的实验研究结果出现不一致性，如下图所示；即使是相同的来源，不同个体之间的间充质干细胞也出现功能上的异质性。

因此，我们必须对目前的研究结果和结论保持一定的谨慎态度，不排除将来的某天培养技术的突破，可以抵消组织来源的差异所导致的MSC功能的差异。

间充质干细胞怎么培养成皮肤细胞

培养的细胞消化后计数，以低密度种96孔板，基本达到平均每孔不到1个细胞的密度。贴壁后（MSC是12h即可），在显微镜下观察，选择只有一个贴壁细胞的孔标记，为单克隆。待细胞达到一定数目后消化收集，可以做后续试验，基本上是保证细胞的纯度的方法，我们在体外诱导时用过。96孔板，平底，用于培养感觉比瓶子还要好，细胞形态可以保持的很好。

附图，孔内的单个细胞 h-MSC

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