脐带间充质干细胞原代培养换液传代冻存（脐带间充质干细胞为什么不需要配型）

我们将包括所有关于脐带间充质干细胞原代培养换液传代冻存和脐带间充质干细胞为什么不需要配型的知识，以帮助你更好地理解两者之间的差异和联系。

细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol

复苏

细胞复苏是指将冻存在液氮或-80℃的细胞解冻，恢复其生长的过程。操作原则：快！慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。

步骤：

1、 准备工作：预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃

在生物安全柜/超净工作台中，准备好细胞培养瓶/皿，并在其中添加足量预热的完全培养基。

如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液，此时也可以准备好 15ml 离心管，在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。

2、 解冻细胞。

做法有 2 种选择：

(1)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速入 37℃水浴，轻摇解冻。冻存管口保持在水面上，以免水浴锅中的水进入管中。

如果冻存细胞的地方离细胞房水浴锅较远，可以准备一个干净的烧杯，烧杯中装 37℃ 水，带着烧杯去取细胞以实现迅速入水浴，或者路上利用体温手搓冻存管到达水浴 时如未充分解冻再投入水浴继续解冻。当冻存管中只剩一点小冰粒时，酒精棉擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/超净工作台。

(2)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速酒精擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/ 超净工作台，向冻存管内加入适量预热的完全培养基，并轻轻吹打以促使细胞融化。这个做法适合冻存管中有足够空间以容纳新加入的新鲜培养基。自己可以尝试一下，哪种方法细胞融化速度快就用哪种方法。个人认为第 2 种快。

3、 接种细胞：

此时做法有 3 种选择：

(1)如果是对冻存液成分耐受的细胞，可将冻存管中的细胞直接吸入准备好的培养瓶/皿， 轻轻十字摇晃混匀细胞，放入细胞培养箱。

(2)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，将冻存管中的细胞吸入准备好的 15ml 离心管中，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。

(3)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，用解冻细胞第 2 种方法的，可以直接用冻存管离心，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。

4、 第二天光镜下观察细胞。如果是带着冻存液一起接种的细胞应进行换液。

细胞换液

细胞换液是指去除旧的培养基，换成新的完全培养基以继续提供细胞充足的营养支持。当旧培养基 ph 值改变（含酚红的培养基通常是变酸发黄）时，需要及时进行换液。

步骤：

1、 准备工作：

预热完全培养基，酒精棉擦拭培养基瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开培养基瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。

如果是悬浮细胞，可以用半量换液法，即吸去一半旧培养基，补充新鲜完全培养基。（会损失一半细胞）。悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。

不光细胞维持培养时需要进行细胞换液，一些实验操作也需要进行细胞换液。当换液操作是实验需要时，可能在添加新的培养基前需要 PBS 清洗细胞以去除旧培养基的影响， 新添加的培养基也可根据实验需求进行特殊配制，不一定是完全培养基。

细胞传代 是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行传代。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。

一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。

用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。

强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。

细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。

当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。

加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。

EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。

TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。

最好控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。

吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。

在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。

将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。

通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。

对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。

细胞冻存 主要为了细胞保种，是指将细胞置于保护性液体中于低温中长期储存的技术。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行冻存。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂、DMSO 或无血清细胞冻存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。准备无菌细胞冻存管和 15ml 离心管，移入生物安全柜/超净工作台。

准备程序冻存盒（恢复至室温）。如果使用添加异丙醇的程序冻存盒，注意异丙醇的量， 如不足，需添加，并且应该根据程序冻存盒说明书定期更换异丙醇。

按细胞传代的做法进行细胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培养基吹打成单细胞悬液。对悬浮细胞而言，无需消化，直接进入下一步离心收集细胞。

将单细胞悬液转移到 15ml 离心管，500g×3min 离心，去除上清。

如使用无血清细胞冻存液，直接吸取无血清细胞冻存液重悬细胞，然后转移到冻存管中拧紧盖子。

如使用自制的细胞冻存液，需要先配制好细胞冻存液，方法如下：

优先使用培养该细胞的新鲜完全培养基配制，900ul 完全培养基+100ul DMSO=1ml 细胞冻存液（DMSO 含量 10%）。

DMSO 在加入培养基时会发热，务必提前配制好冻存液，以免过热损伤细胞。

对于娇弱的细胞，可配成 2×细胞冻存液，先使用一定体积新鲜完全培养基重悬细胞，再逐滴滴加等体积 2×细胞冻存液（DMSO 终浓度还是 10%），吹打混匀，转移到冻存管中。

自制细胞冻存液中的 DMSO 可适当降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。

在冻存一些比较娇弱的原代细胞时，冻存液中的完全培养基可以用胎牛血清替代，即冻存液中只含胎牛血清和DMSO。

冻存细胞的量可以参考传代时的比例，原则是让复苏的细胞有充足的生长空间。推荐使用内旋式细胞冻存管，比较安全。

有些细胞冻存管的管盖设计是特殊的，当第一次感觉拧紧时，此时并没有真正拧紧，可以进一步拧，直到第二次感觉到拧紧。推荐使用这样的冻存管，在温度变化发生热胀冷缩时不容易发生液体泄漏，减少污染的可能性。

使用无血清冻存液重悬的细胞，无需程序降温，直接塞-80℃冰箱降温，第二天转移到液氮中。

使用自配细胞冻存液的细胞，需放进程序冻存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天转移到液氮中。

-80℃不适合长期保存冻存细胞（大概 1-2 年吧）。液氮中冻存的细胞十年之久都可以复苏成功。如需要更长期地保存细胞，应该定期复苏细胞后再次冻存。

程序冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。

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干细胞冻存有哪些好处？

干细胞具有自我更新能力、高度增殖以及多向分化的潜能，是人类组织器官的起源细胞。当人体组织器官出现损伤和衰老时，医生们可以用与病变组织器官相对应的干细胞来进行修复，以达到治疗疾病和抗衰老的目的。因此，干细胞又被称为“万用细胞”，是再生医学的核心成分，具有巨大的医学和临床应用价值。



干细胞分类及其应用

干细胞有两种分类方法。一种是依据其主要功能分类，如多能的间充质干细胞以及专能的造血干细胞、神经干细胞、心脏干细胞等；另一种是按所处发育阶段分类，分为胚胎干细胞、围产干细胞和成体干细胞三类。

胚胎干细胞可以向所有组织细胞分化，但不加控制便会在体内形成畸胎瘤，因此不能直接体内应用，需将其分化成多能或专能干细胞后才可使用。这包括诱导多能干细胞（iPSC），日本学者山中申弥因iPSC的研究获2012年诺贝尔生理学或医学奖，自此日本政府将其项目列为“新经济成长战略”的重要支柱而大力支持。然而，山中申弥也承认，iPSC应用于临床有风险。国内外许多实验室发现iPSC在培养过程中基因太不稳定，基因异常的细胞过多，有些实验室因此终止了iPSC研究。

围产干细胞指的是胎儿在母体内发育成长所必需的附属器官——脐带、胎盘组织中的干细胞。围产干细胞的增殖分化能力较胚胎干细胞弱、比成体干细胞强，可以向绝大多数组织细胞分化，但围产干细胞不会形成畸胎瘤，动物和人体试验已证明是安全的。围产干细胞来源丰富、增殖分化功能强、临床使用安全，目前看来是最具临床应用前景的干细胞。

成体干细胞来源于人体体内组织中的干细胞，应用最广的是骨髓和脂肪来源的干细胞。如公众所熟悉的骨髓造血干细胞移植，至今已有半个多世纪的临床应用历史，已成为难治性恶性血液病和再生障碍性贫血治疗的最终选项。除造血干细胞外，成体组织还有许多其他干细胞，如牙髓干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、角膜干细胞等。成体干细胞因需从人体中抽取，一般用于个体化治疗。

围产期干细胞

干细胞是一种珍贵的生命资源，在医疗研究领域有着巨大的前景，随着干细胞研究的发展，预先储存干细胞，就像有了一个健康银行，未来能为每个家庭带来健康保障和希望。目前，非常流行的一种健康保险就是储存新生儿干细胞，也就是围产期干细胞。

科学家和研究人员认为，临床前应用最多且无明显伦理障碍的治疗用干细胞，主要来自胎盘、脐带组织和脐带血。新生儿干细胞是宝贵的生命资源，也是目前用于干细胞治疗的理想种子细胞。

脐带间充质干细胞

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。据美国国立卫生研究院（NIH）临床试验的数据信息库、美国国家生物技术信息中心及国内相关研究资料显示，目前可搜索到超过700项已经完成或正在进行的与间充质干细胞相关的临床研究，其中在中国进行的有150余项，130种既往药物治疗无效或者效果很小的疾病，有望通过脐带间充质干细胞进行治疗。

胎盘干细胞

胎盘干细胞和胎盘的其他细胞有一个控制免疫反应的作用。这给胎盘干细胞的应用提供了一个非常大的发展空间：一是胎盘干细胞可以直接服务于母亲和小孩;二是由于胎盘干细胞的免疫原性非常弱和免疫调控作用，它甚至可以惠及家族成员。胎盘干细胞的应用近年来逐渐成为科学研究的“新宠”，成为干细胞行业发展的趋势。在美国国立卫生研究院的最大临床试验注册库ClinicalTrials.gov网站上，胎盘干细胞的临床实验已有22项，主要集中在北美，其中中国境内有四项。从论文的数量发表，中国在干细胞领域紧随美国，排名第二。在骨髓、脐带和胎盘来源的MSC论文发表超出美国。至2014年8月15日全球关于胎盘干细胞的论文发表数量有518篇，发表治疗相关的疾病包括：重型再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病等恶性或非恶性血液疾病，还有二型糖尿病、特发性肺纤维化、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎等非血液系统疾病。

富含干细胞的脐带、胎盘等围产期组织的采集最佳时机是在您的宝宝娩出、胎盘脐带和胎儿完全分离后进行的。这一过程非常简单，不需要进行麻醉，无痛、无副作用，只需几分钟，在大多数妇产医院中皆可完成。取样人员是受过专门训练的助产医生或护士，因此取样过程不会对产妇分娩过程和胎儿产生任何不良影响。

作为一种宝贵的生命资源，每个家庭对围产干细胞都有现实或未来的需求。然而，公众对此了解还不多。我国每年有1500万新生儿，而目前全国每年能保存脐带或胎盘干细胞的家庭不超过20万，绝大多数的胎盘脐带都被丢弃。

专家呼吁：围产期干细胞是新生儿赐予人类的一份厚礼，爸爸妈妈们一定不能辜负。储存干细胞，可为宝宝和家人的健康保驾护航！

新生儿有必要存储脐带细胞吗？

新生儿的脐带可以保存，有一定必要性，但是要根据家庭的实际情况来选择，如果有一定的经济基础的话，可以存储。一直以来，在孩子出生之后，脐带被很多父母当作“废弃物”处理。近几年，随着科学技术的发展，人们对脐带的认识越来越深，越来越多的父母在孩子出生之后将孩子的脐带干细胞存储到专业的细胞存储机构。现代医学的进步让未来拥有无限可能。干细胞作为再生医学的宝贵资源，有着非常广泛的研究和临床应用空间。

其中，脐带组织来源的间充质干细胞几乎可以分化为人体所有的组织细胞，连续传代培养和冷冻保存依然具有强大的分化能力。脐带间充质干细胞有着“万用细胞”之称，具有亚全能分化潜能，能分化为心脏、肝、肾、肺、等多种组织细胞，几乎涵盖了人体的所有组织细胞。其独特的免疫调节功能，具有巨大的医学临床应用价值，是细胞治疗最理想的种子细胞。脐带干细胞的优势与保障宝宝存储 全家可用一人存储，全家受益。

希望可以帮助你！

刚关于干细胞提取，你想知道的都在这

干细胞在医学界被誉为“第三医疗手段”，是区别于传统手术治疗和药物治疗的革命性医疗手段，在治疗各种难治性疾病、罕见病方面具有自己独特的优势。

随着年龄的增长，人体免疫力会逐步下降，此时身体开始出现各种疾病，体内细胞的活性以及数量也会相应减少，身体器官以及机能的修复再生能力下降，此时给身体补充干细胞，组织器官就能得到及时修复，疾病也会很快痊愈。

干细胞是一类具有多项分化潜能和自我复制能力的未分化起源细胞，也被医学界称为“万用细胞”。生老病死的各个阶段都是由细胞所决定的，当体内的细胞数量与质量逐步降低，无法及时有效的替换补充体内衰老病变的功能细胞时，疾病与衰老就会到来。

而干细胞可以利用自身的分化作用修复受损的组织器官，能够分化为身体所需要的组织器官细胞来补充损失的细胞，代替那些衰老受伤的细胞恢复受损组织器官的功能。

干细胞能再生各种人体组织，可以分化成牙周组织、神经等组织细胞，将来还可以用于器官组织的再生，并且还有抗衰老的功效，补充干细胞可以有效去除皱纹，恢复肌肤光泽弹性，有着显著的美容护肤效果。

有哪几种干细胞值得我们提取储存？它们又分别有什么区别和作用？

一、脐带干细胞

脐带干细胞已经成为了具有共识性的，安全有效的间充质干细胞样本来源。脐带干细胞一般指脐带间充质干细胞。

脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它的增殖能力比较强，能分化成许多种组织细胞，做异基因移植的时候，也很少出现排斥的反应，能攻克许多难治性慢性病，还可以修复衰老的组织器官，抵抗人体衰老。

提取并储存脐带干细胞相当于给新生儿及其父母上了一份保险。

二、骨髓、脂肪干细胞

如果在出生时没有储存脐带干细胞，成年后再想储存自己的干细胞就要抽取骨髓干细胞或脂肪干细胞，这两种干细胞是成年人干细胞的最佳来源，其中脂肪干细胞的活性要强于骨髓干细胞。

脂肪干细胞提取过程容易，只需要通过微创在腹部提取20cc的脂肪。先将样本放在–80 °C冰箱过夜，第二天再转移到液氮进行长期储存。脂肪干细胞在体外扩增技术成熟，可以保管30年左右。

干细胞在生命科学、新药试验和疾病研究这三大生物医药领域都有着广泛的运用，不仅在疑难杂症上初露锋芒，也在常见病、医美方面崭露头角。近年来，我国干细胞产业发展迅猛，相信随着生物医学的不断发展

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