获得胚胎干细胞的方法（怎样获得胚胎干细胞）

我们希望我们在这篇文章中获得胚胎干细胞的方法的讨论能给你传授一些有价值的知识，所以请仔细阅读我们所提供的内容。

怎样获得人类胚胎干细胞

我知道“脐带血”可以获得“造血干细胞”。

人类胚胎干细胞可以运用“克隆技术”获得。

以下内容引自网络：

新华网 （ 2004-02-12 16:22:41 ） 稿件来源： 新华网

新华网华盛顿2月11日电（记者毛磊）美国《科学》杂志11日宣布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细胞。

汉城国立大学和美国密歇根州立大学等机构的科学家参与了这项研究。16名健康妇女为这项研究志愿捐献了242个卵细胞以及被称为卵丘细胞的体细胞。科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用化学手段刺激卵细胞分裂，共有30个克隆细胞经过约7天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被称为胚囊的早期胚胎阶段。

科学家们从这些胚囊中分离出20个内层细胞团，并在此基础上最终获得一个人类胚胎干细胞系。实验显示，利用这种办法获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。

韩国研究人员表示，新成果给治疗性克隆的应用“打开了大门”。《科学》杂志总编肯尼迪评论说，新成果确实令人鼓舞，但也应该认识到，胚胎干细胞技术可能还需几年才能真正投入应用。

此前，美国先进细胞技术公司曾宣布克隆出含十几个细胞的人类早期胚胎，但一直未在学术刊物上发表成果。而其他研究人员进行的人类胚胎克隆和猴子克隆实验基本未获成功，一些科学家甚至认为现有克隆技术无法应用于灵长类动物。韩、美科学家指出，新成果证明，利用来自活体的体细胞克隆人类早期胚胎并从中获取干细胞是可行的。

韩美科学家的研究成果将于本周发表在《科学》杂志网络版上。在西雅图举行的美国科学促进协会年会12日还将就此举行新闻发布会。（完）

胚胎干细胞，是怎样制取的？

通常是显微操作提取体外受精胚胎的囊胚内细胞团细胞，经过选择性体外培养扩增得到的一类细胞。

胚胎干细胞 如何产生

胚胎干细胞:是在胚胎期间,尚未分化的细胞

脊髓无法产生成胚胎干细胞!

但如果脊髓有受损,可以利用胚胎干细胞进行修复

具体原理是诱导胚胎干细胞向脊髓神经细胞分化,

从而利用新分化产生的完好的脊髓神经细胞来填补漏洞

美国刚刚放开了 利用胚胎干细胞医治脊髓的应用于人的临床实验,

但临床实验尚未完成,还有很多是未知数

囊胚获得胚胎干细胞的部位

（1）核移植时采用的卵母细胞是指发育到减数第二次分裂中期阶段的；卵（母）细胞中有促进细胞核全能性表达的物质，因此受体细胞一定要卵母细胞．

（2）胚胎干细胞来源于早期胚胎（囊胚的内细胞团）和原始性腺，因此待这些胚胎在体外发育到囊胚后，从囊胚的内细胞团分离并建立单倍体胚胎干细胞系．

（3）单倍体胚胎干细胞与卵母细胞完成受精并发育成小鼠运用的技术主要有体外受精和胚胎移植．

（4）获得三倍体小鼠的方法：将正常鼠的体细胞核移植到去核卵母细胞中，让该细胞与单倍体胚胎细胞受精．

故答案为：

（1）减数第二次分裂中期 卵（母）细胞中有促进细胞核全能性表达的物质

（2）内细胞团

（3）体外受精 胚胎移植

（4）将正常鼠的体细胞核移植到去核卵母细胞中，让该细胞与单倍体胚胎细胞受精

如何获得胚胎干细胞？

小鼠ES细胞

小鼠ES细胞的分离方法基本成熟，且已广泛应用于生命科学研究的各个领域。1981年Evans首次分离得到小鼠ES细胞，他以手术切除受精后2.5 d小鼠卵巢并结合激素注射干扰子宫环境，从而使胚胎延迟着床，再回收胚胎，将其体外培养于STO细胞饲养层上，结果得到了小鼠ES细胞系。Martin G R以免疫外科法剥离小鼠囊胚滋养层细胞，得到内细胞团(ICM)并将其置于STO细胞饲养层上，培养基为小鼠PSA-1 ES细胞条件培养基，结果也得到小鼠ES细胞。此后，Axelord等用微滴法得到小鼠ES细胞系；Kaufman等用单倍体延迟着床小鼠囊胚建立同源二倍体ES细胞系；Wobus等首次用原代小鼠成纤维细胞作饲养层建立了小鼠ES细胞系；Smith等首次使用大鼠肝细胞条件培养基作为分化抑制物建立了小鼠ES细胞系。Brook F A等进一步完善了小鼠ES细胞的分离方法，以致从许多品系小鼠包括近交系和突变系，都可获得ES细胞。 体细胞核移植

分离小鼠ES细胞并非只能从囊胚，也并非必须依赖饲养层细胞。Dhhaise等将52枚8-细胞小鼠胚胎消化成单个分裂球并培养于小鼠原代成纤维细胞饲养层上，所用培养基为DMEM/F12，并添加100 mL/L的胎牛血清、100 mL/L的新生犊牛血清和0.1 mmol/L的2-巯基乙醇，5天后，出现多个干细胞集落，消化传代后建立了一个ES细胞系MSB1。将MSB1注入SCID(severe combined immunodeficient mice)小鼠，能产生包含三胚层分化物的畸胎瘤，注入52枚囊胚产生了2个活的个体(1雄，1雌)，但雄性个体无生殖能力。Tojo等用同样方法从杂交小鼠(C57BL/6×DBA/2)8-细胞胚也得到了ES细胞。小鼠ES细胞具有无限增殖的自我更新能力。Suda Y等将小鼠ES细胞传250代以上没有出现转化的迹象，它们仍具有正常的二倍体核型；在生殖系嵌合体中能产生正常的配子；作为核供体能重组克隆胚胎。上述结果表明小鼠ES细胞是永生性的。

大鼠ES细胞

Iannaccone P M等从大鼠PVG近交系分离克隆大鼠ES细胞系-RESC-01，该细胞系对SSEA-1和AKP呈阳性，在大鼠胎儿成纤维细胞饲养层上能很好的增殖，在体内环境能分化形成多种细胞类型。RESC-01细胞系在体外悬浮培养时形成的胚体出现有节律的收缩运动，将其注入囊胚并移植假孕母鼠能生成嵌合体。Kawase等也利用大鼠胎儿成纤维细胞做饲养层，从DA大鼠品系分离建立了RES-DA1ES细胞系，它与小鼠ES细胞形态相似，表达AKP和4C9抗原。Brenin等也用不同的方法分离得到了ES细胞。Sun等以大鼠ES细胞为核供体，得到了核移植后代。Vassilieva等发现大鼠ES细胞表达SSEA-1、Oct-4和IL-6等细胞标记。

猪ES细胞

Piedrahita J A等采用STO、猪成纤维细胞和猪子宫上皮细胞作为饲养层，以DMEM为基础培养液，从猪囊胚ICM分离ES细胞，发现猪囊胚ICM在STO或PMEF饲养层上可以附着增殖，而在猪胎儿成纤维细胞饲养层上虽可附着但增殖甚微，传不过4代即发生死亡。Evans等将6天～7天猪囊胚直接培养于STO饲养层上，挑出ICM细胞经增殖传代培养建立了猪ES细胞系。Strojek R M等认为分离猪ES细胞的最适胚胎为第10天囊胚。研究表明，6日龄～7日龄胚胎在培养过程中极易发生死亡，IC

胚胎干细胞研究(16张)M克隆获得率极低，而第10天的胚胎容易培养，ICM克隆获得率较高，但细胞易于分化。Vasil’ev I M等研究了胚胎发育阶段、培养基种类、饲养层细胞等影响猪ES细胞分离的因素，结果表明不同发育阶段的附植前囊胚是影响猪ES细胞分离的限制性因素。Wheeler M B等报道猪ES细胞能形成正常的嵌合体和包含三胚层分化物的囊状胚体，在维甲酸和DMSO的作用下，猪ES细胞能分化形成上皮细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等，Miyoshi等从体外授精囊胚分离得到猪ES细胞，并以类ES细胞为核供体，获得了核移植囊胚。国内关于猪ES细胞分离克隆的研究相对较少，李松等分离得到猪ES细胞并传至第2代，在此基础上，徐军等将猪ES细胞传至3代，冯秀亮等将猪ES细胞传至5代，冯书堂等也分离得到猪ES细胞，同时对所分离的细胞进行了初步检测和鉴定，证明其具有多能性。

牛ES细胞

Saito等在加有LIF的培养基中对牛ICM进行培养，分离得到牛ES细胞并进行传代。Sims等使用与一般ES细胞分离完全不同的低密度培养法，使用BRL(buffalo rat liver)条件培养基并添加亚硒酸钠、胰岛素、运铁蛋白和50 mL/L胎牛血清，培养6 d～10 d，得到15个ES细胞系，将其作为核供体进行核移植得到659枚重构胚，卵裂率70%，囊胚率24%，将其中34枚胚胎移植27头假孕母体，13头妊娠，最后生出4头犊牛。而Stice S L等报道，以牛ES细胞为核供体建立的重组胚在移植受体后虽然会出现妊娠现象，但妊娠时间不超过60天，主要是因为胎盘畸形发育，包括缺乏子叶以及子宫阜出血反应。若将重组胚与正常8-细胞胚嵌合，则该嵌合胚可发育至85天，胎儿同样缺乏子叶，DNA分析证实50%的嵌合体胎儿组织来源于ES细胞。Ito等分析比较了牛体内和体外培养的桑椹胚分裂球和囊胚ICM分离ES细胞的效果，结果仅在囊胚组获得了类ES细胞。Cibelli等由49枚7日龄牛胚胎ICM分离到27个ES细胞系，用注射法将β-半乳糖苷酶基因导入ES细胞，选择转染的ES细胞注入8-细胞～16-细胞牛胚，其中18枚胚胎移植7头受体，妊娠5周后，得到12个胎儿。对胎儿进行检测，6个胎儿分别在生殖腺或原始生殖细胞(PGCs)中检测到标记基因，表明ES细胞参与生殖系嵌合。Cibelli等建立应用牛胎儿成纤维细胞核移植生产转基因牛类ES细胞的方法，得到6头嵌合体。Mitalipova等自致密桑椹胚分离牛ES细胞，最高一株ES细胞传至150代，且表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4和c-kit受体。

羊ES细胞

Handyside等以绵羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞作饲养层，从7日龄～8日龄绵羊囊胚分离类ES细胞，结果得到内胚层样细胞而无ES细胞出现。Tsuchiya用免疫外科法分离8 d～9 d绵羊囊胚ICM，培养于STO细胞饲养层上，得到2个类ES细胞系，传至4代。Tillmann等用胎牛肝成纤维细胞作饲养层分离得到传至20代的绵羊类ES细胞和40代的山羊类ES细胞。Modinski等将绵羊ES细胞与囊胚嵌合得到2只嵌合体绵羊。Campbell等用第1代～第3代的类ES细胞作核供体进行核移植，得到了4只绵羊。

兔ES细胞

Graves K H等从兔子附植前囊胚分离得到ES细胞，并进行了初步鉴定，证明它们具有在饲养层上保持未分化状态的增殖能力，体外传代培养1年以上，仍具有正常的核型，且能形成包含三胚层分化物的胚体。之后，Niemann等以PMEF为饲养层，建立了9个兔ES细胞系。Schoonjans L等将兔ES细胞注入囊胚获得了包括生殖系在内的嵌合体兔子。陈颖等以PMEF为饲养层培养兔分割囊胚，结果得到传至7代的兔ES细胞，将第2代的兔ES细胞与囊胚进行嵌合，得到1只皮毛嵌合体仔兔，但未证实ES细胞是否参与了生殖系嵌合。

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