脐带间充质干细胞原代培养消化法（脐带间充质干细胞的培养）

这篇文章的目的是以帮助你的方式讨论脐带间充质干细胞原代培养消化法和知识脐带间充质干细胞原代培养消化法。

间充质干细胞预处理最新方法

间充质干细胞预处理最新方法如下。

1、在间充质干细胞在细胞收获前1220h，向培养基中加入TNF因子、IL因子、三七总皂苷注射液、低分子肝素盐进行诱导处理。

2、将诱导完成的间充质干细胞用胰蛋白酶进行消化，然后终止消化，离心，收集沉淀，对沉淀进行重悬，清洗，最后保存。

干细胞消化传代要注意哪些问题？

一、贴壁细胞的消化 :

常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。

1、 酶消化法

贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式：1）、加入胰酶等干细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；2）、加入胰酶后，镜下观察待干细胞开始脱落时，弃去胰酶，加入培养液并分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对干细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。

常用的消化酶有:

1）、胰酶 这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。

2）、胶原酶 这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下干细胞。这种方法作用温和，对干细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。

胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素之一，如果配的比较标准，消化的时候就容易消化，反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下，如果干细胞下来的比较多了，这时可以连同CMF或PBS加上营养液一起传。营养液中有血清，胰酶遇到血清就会自动终止消化，但这样操作对干细胞是有一定的影响的。

对于容易消化的干细胞，加入PBS缓冲液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞。

在此介绍一种简单省事并且效果好、不损失干细胞的方法：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和并分瓶。

这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对干细胞的活性损伤较大，并有部分干细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则干细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤干细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。

2、离子螯合剂

离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测干细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。

1）、EDTA 用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度，它不能被中和。因此，消化下来的干细胞要洗一遍。

2）、商品化的无酶消化液 有些消化酶液对干细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

对于较难消化的干细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打。或者是弃去培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃去大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有干细胞脱落。但大量使用EDTA对干细胞有损伤作用。也可以先用PBS把干细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在少量干细胞消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样干细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀。

3、物理法：直接吹打或用细胞刮子将干细胞刮下来。

4、冷冻法：

此方法仅能用于细胞传代时无法使组织上的细胞脱落下来的情况。本方法的原理是因干细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对干细胞损伤小，不需要中止或洗干细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的干细胞。不足是干细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1）、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3）、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4）、按一定比例传代。

消化时间和干细胞类型、消化液的消化能力、干细胞的密度等多种因素有关。干细胞消化过程要注意消化时间。一般养一种新的干细胞要摸索一下消化时间，掌握干细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与干细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待干细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若干细胞密度过大则消化后干细胞易成团。

消化时间不应超过5分钟，否则对干细胞损害很大。消化液覆盖干细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷干细胞，当干细胞收缩，部分干细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上干细胞。

在消化过程中经常出现细胞铺不开的问题，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。

二、 贴壁干细胞的传代扩增

贴壁干细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对干细胞进行传代扩增。

对于贴壁不太紧的细胞，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的干细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为：

• 将长成致密单层干细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；

• 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；

• 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；

• 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

传代细胞培养注意事项：

1.严格的无菌操作 .

2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养干细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

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肝病：成效显著的干细胞疗法

肝脏的功能：

肝（Liver）是人体最大的腺体，其功能极为复杂和重要，具有分泌胆汁、分解糖与储存糖原、解毒及吞噬防御等功能。

肝脏是人体以代谢功能为主，类似加工厂，其主要生物学功能包括以下几点：

解毒功能：人体内大部分毒性物质均在肝脏被分解代谢为无毒或低毒性物质，其方式包括氧化、水解、还原等。如果肝脏严重受损或慢性肝病，如肝硬化、肝炎等，导致肝功能下降，毒性物质会在肝脏累积，进一步加重肝脏损伤并引起其他功能器官代偿性受累。

分泌功能：主要分泌胆汁，肝脏细胞生成胆汁，储存在胆囊中，当小肠内食物需要消化时，胆囊自动收缩，排入肠道以帮助食物消化吸收。肝功能减退或胆管阻塞时，消化功能会受此影响，胆管阻塞致使胆汁回流血压会出现黄疸，表现为皮肤黏膜变黄。除此之外，干细胞还分泌肝细胞生长因子等促进肝细胞分裂增殖。

代谢功能：主要包括分解代谢、合成代谢、能量代谢三方面。人体摄入的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素等，吸收后输送到肝脏，在肝脏组织被分解为氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等小分子化合物，再根据人体需要合成所需蛋白质、碳水化合物和脂肪，从而调节人体代谢与能量平衡，是三大代谢物转化利用的场所，如果肝功能受损，代谢平衡就会失调，引发代谢异常性疾病。

免疫防御功能：除肝脏的解毒功能外，肝脏还有一些具有吞噬功能的吞噬细胞，其主要是吞噬、消化处理血液颗粒物，后经免疫进一步清楚；除此之外肝脏内淋巴细胞也十分丰富，在机体产生炎症反应时，一部分可被运到肝脏。

肝脏具有强大的再生能力，小鼠实验中切除其三分之二肝脏，约在两个月会成长为原来大小，其功能得到恢复。肝脏如此惊人的再生能力与肝脏干细胞有关，目前已证实其涉及肝细胞、肝脏干细胞、骨髓干细胞等。

正常组织更新的肝脏更新是靠肝脏原位干细胞分裂介导，在肝脏受到轻微损伤时便可由自身经多种生长因子和转录调控参与，激活肝细胞再生，使肝脏体积和功能得到恢复。当肝脏损伤十分严重，如肝脏大部分 肝组织切除、严重肝坏死等，其肝脏的再生则需要肝肝细胞及肝外循环的造血干细胞等进入肝脏，后进一步分化为肝细胞。

肝损伤是一种临床上常见的疾病，全球约有17亿人患有不同类型的肝病，因各种理化因素均可导致肝损伤，严重或持续性肝损伤最终可导致肝功能衰竭，甚至危及生命。肝病主要包括机械性肝损伤、病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化和肝癌等，尤其是病毒性肝病、肝硬化、肝癌和自身免疫性肝病的治疗，现代医学手段往往治疗效果有限，很难取得理想的治疗效果。

肝硬化（Liver cirrhosis，LC）是临床上常见的慢性进行性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥漫性肝脏损害。引起肝硬化的病因很多，主要是由病毒性肝炎所致，如乙型肝炎、丙型肝炎等，另外还有酒精肝、脂肪肝、胆汁淤积、药物、营养等方面的因素长期损害所致。每年死于肝硬化的患者达数十万人。

中晚期肝病通常累积广泛肝细胞，其再生能力下降，造成肝功能失代偿并最终导致肝功能衰竭，也是肝脏疾病的终末表现。目前对于中晚期肝病的治疗，主要有内科综合保肝治疗，但效果欠佳，病死率很高；生物人工肝系统治疗、但干细胞来源不足、存在免疫排斥反应；原位肝移植是唯一有效办法，但肝源有限，价格昂贵，极少部分可接受移植治疗。与这些治疗方案相比，因此进行干细胞移植能使受损肝脏细胞得以补充，因 其具有很强的自我更新能力、独特的免疫调节作用和跨胚层多向分化潜能，可以使组织功能得以恢复，安全可靠，价格低廉，逐渐成为肝病的又一治疗手段。

疗效与机制

迄今为止，国内外已对间充质干细胞修复肝损伤的作用和机制进行了部分研究，证明其对肝损伤均有疗效并在临床上取得一些显著的进展。其作用机制主要包含以下三个方面：

定向分化为肝细胞： 体外实验已证实间充质干细胞可被诱导分化为肝细胞，并且具有分泌细胞生长因子和抑制肝脏炎症的作用。诱导后的细胞表达肝细胞部分表型标记，且能够合成白蛋白。动物实验已证实通过静脉回输脐带间充质干细胞会归巢到已损伤的肝脏部位，表达肝细胞表型，使肝功能得到改善。

实验证明持续性肝损伤可以显著提高脐带间充质干细胞的归巢性。其归巢性作用机制研究表明，趋化因子家族及其受体是操控脐带间充质干细胞向肝组织迁移的重要因子，基质细胞衍生因子等对于脐带间充质干细胞动员、有效定植于受损组织起到重要作用。

旁分泌作用 ：在研究发现移植脐带间充质干细胞在动物模型中的分布情况时，一直以为其直接参与了肝损伤的修复，并且认为这可能是唯一机制。但随着研究的深入，人们发现，在损伤修复方面，脐带间充质干细胞分泌的多种生长因子和外泌体不仅参与促进损伤修复，而且其作用比直接转化为肝细胞更为重要。其作用主要表现在以下方面：促进自体干细胞动员及肝细胞再生，促进胆管、毛细血管生成，抑制肝纤维化，低免疫源性。对移植后的体内跟踪实验显示，移植后的脐带间充质干细胞主要分布于肝脏结缔组织中。通过分泌生物活性因子恢复肝功能并促进肝再生。在肝脏再生通路中会起到促进肝细胞样细胞、胆管细胞、血管内皮样细胞分化、成熟中起到重要作用，有助于胆管的形成和解耦维持、新生血管形成及肝细胞增值。

炎症调节： 无论什么原因导致的肝损伤，其病变发展过程中大概率始终伴随着肝脏的炎症反应，而炎症反应本身也是肝脏的基本病理过程，是导致肝细胞坏死、凋亡及肝功能退化的继发因素。炎症反应是肝脏受到理化和生物因素引起的疾病发展因素，特别是在慢性肝病发展过程中起至关重要的作用，因此抑制其 病变过程中的炎症反应也在治疗肝损伤中有重要作用。脐带间充质干细胞能够分泌细胞因子及细胞间接阻扰抗原呈递细胞的功能，阻止B细胞分化，抑制T细胞和NK细胞炎性反应，上调抗炎因子，分泌拮抗剂从而减轻炎性反应。

治疗方法：

脐带间充质干细胞治疗急性肝炎、自身免疫性肝病的疗效确切，可以有效控制该病的发展和缓解效果，部分发病早期的患者甚至可以治愈，但不同类型的肝病或同种类型肝病处于不同状态的患者疗效差异较大，因此选择合适的适应症和治疗时机尤为重要。对于严重肝硬化患者，脐带间充质干细胞治疗可显著提高生活质量，其内在机制可能是可提高白蛋白的合成，关于是否可以延长患者生存期目前尚无定论。

因此，在实施细胞治疗过程中，确诊和正确评估肝病发展过程，选择合适的治疗方案极为重要，目前主要的方案有以下几种：

肝门动脉介入： 此技术临床上常用语肝癌化疗药靶向注射，技术相对成熟。其方法是在CT、血管造影等引导下，行股动脉穿刺，通过穿刺通道将导管直接插入肝损伤组织附近的动脉血管内，然后将脐带间充质干细胞注射 到肝动脉内。这种方法理论上讲脐带间充质干细胞进入肝脏时间短、作用更快，发挥作用机会更多，疗效更明显，目前临床数据较少，尚不具统计学意义，其疗效差异可能与输注细胞数量、时机和肝损伤程度及进展有一定关系。

皮下静脉注射： 此方法与普通的静脉输液相同，是通过外周静脉穿刺回输脐带间充质干细胞，简单易行，患者容易接受。现已有报道此方法治疗酒精性肝硬化患者，其肝功能得到改善，真实其移植途径是切实可行的。在治疗其他肝损伤报道中，其肝功能改善，炎症坏死减轻，炎症细胞浸润数量减少，证明将外周静脉输注作为治疗肝损伤移植途径是较为简单易行的有效方法。

肝门静脉注射： 此方法实在影像学引导下，穿刺注射针直接插入肝门静脉，将脐带间充质注射，学者推测此方法是最理想的治疗手段，因肝门静脉直接与肝窦相连，血流相对缓慢，在肝组织停留时间长，但此种方法技术要求比较高。临床上有研究用此种方法治疗肝切除再生情况，效果显著，是一种新的治疗方法选择。

肝组织内注射：该方法在影像学引导下治疗局部肝损伤，将脐带间充质干细胞直接通过套管针芯直接注射进入肝组织。该方法靶向明确、直达病灶，缺点是操作难度较高，易引起出血，临床报道较少采用。

除此之外，还有基因修饰脐带间充质干细胞或联合肝细胞生长因子治疗肝病，其可以加强疗效并且针对性更强，理论上优于单纯的脐带间充质干细胞治疗。目前针对肝脏主要是导入促肝细胞生长因子基因，这种方法还可用于体外培养，诱导使脐带间充质干细胞转化为肝细胞样细胞之后，再用于肝病治疗。

目前临床上采用较多的 移植方法为肝动脉注射法和肝静脉注射法，主要是因为可操作性强，患者容易接受，可反复多次治疗。通过静脉回输的方式导致到达肝损伤 的数量相对较少，但可随血液循环进入全身受损伤的组织，是一种整体治疗方案。

注意事项

针对脐带间充质干细胞移植治疗肝病应避免患者有细菌、病毒等感染并发症，如患有此类因素 ，应对症治疗后再进行移植治疗。一些免疫抑制药物、化疗药物、抗生素对脐带间充质干细胞活性有明显影响，在治疗过程中应避免或减少此类药物的使用。治疗后应使用易消化的食品，避免 酒精及辛辣食品刺激类食物，以清淡食物为主，尽量减少油腻食物，适当补充维生素及保肝利胆类药物的治疗。避免剧烈运动，注意痛风保暖和静养休息，积极进行心理疏导，缓解患者紧张、忧虑的情绪。注意观察和收集治疗过程中及治疗后患者的临床表现和心理变化，结合相关复查结果分析治疗效果。

求助人脐带间充质干细胞提取方法

方法:

无菌条件下截取流产胎儿双侧四肢骨,PBS冲洗髓腔,离心去脂肪及上清液,L-DMEM重悬细胞,沿管壁缓慢滴加至底部有等量1.073 g/mL Percoll分离液的离心管中,离心后吸取中间界面白膜层,加入含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素钠、链霉素的L-DMEM完全培养基,接种后置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内培养.48 h后换液,去除未贴壁细胞,以后每2d换液一次.待细胞达到80%～90%融合时,胰酶-EDTA消化传代.

主要观察指标:

倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞技术检测其表面标记物;碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成软骨分化能力.结果:原代及传代培养的胎儿骨髓间充质干细胞呈梭形外观,具有较强的增殖能力.胞体较小,细胞核/浆比例大,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆少,染色质较疏松,表现出早期细胞的特点,传至第20代细胞超微结构仍无明显改变.细胞表面抗原CD29,CD44,CD105呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达.骨髓间充质干细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原均呈阳性.

结论:

利用密度梯度离心+贴壁筛选法可成功分离培养胎儿骨髓间充质干细胞,所获细胞能够向成骨细胞及软骨细胞分化,该方法为体外培养扩增胎儿骨髓间充质干细胞的简单、稳定、高效的手段.

原代培养在生命科学研究中有什么应用？其优势是什么

原代培养（primary culture）又名初代培养，是从供体取得组织细胞后的首次培养。其特点是细胞或组织刚离开机体，生物性状尚未发生很大的改变，一定程度上反映了它们在体内的状态，表现出原组织或细胞的特性。对于药物实验研究，原代培养是一种很好的实验技术。由于原代培养的组织含有多种细胞成分，即使生长出同一种类型的细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织的类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因此原代培养细胞的部分生物学特征尚不够稳定，在进行较为严格的对比性实验研究时，还需先对细胞进行短期传代。近年来，原代培养技术已被广泛应用于中医药研究尤其是中药研究之中。1 原代培养技术1.1 组织块培养法 组织块培养法即将组织剪切成小块后接种于培养瓶，简便易行且成功率较高。但由于反复剪切和接种过程对组织块易造成损伤，因此并不是每个小块都能长出细胞。此法适于细胞数量较少的原代培养，如牙髓细胞培养等。1.2 消化培养法 用酶制剂（最常用的是胰蛋白酶）处理组织块，除去细胞间质，使细胞相互分离形成单细胞悬液，大多形成单层细胞生长方式。本法的优点在于单层细胞更易摄取营养及排出代谢产物，因此生长较快。但操作不慎易于造成污染，且消化处理须恰到好处，否则会对细胞产生一定的损伤。随着实验技术水平的提高，目前此方法已被较多地应用于研究之中［1］。2 原代培养技术在中医药研究中的应用 综合近十年来的文献报道，体细胞、血细胞和肿瘤细胞的原代培养技术较为成熟，已被应用于中医药的研究之中，尤其是肝细胞和神经细胞的原代培养，其应用更为广泛。2.1 用于中药药理学研究 中药药理学研究是目前应用原代培养技术最广泛的领域，被称为中药的生物学效应研究，用以了解中药的细胞药理与毒理作用。与体内整体实验相比，体外实验具有简便迅速、条件易控制、药理靶点与环节较为清楚等优点。2.1.1 用于药效学研究 利用原代培养技术研究中药有效成分和复方的作用效果和机制，是从分子水平研究药效的重要手段。 朱陵群等［2］研究发现：原代培养的大鼠海马神经细胞缺氧、缺糖5 h后再给氧，可诱导神经细胞凋亡和细胞坏死，并显著增加细胞内Ca2＋浓度和乳酸脱氢酶的释放，且随再给氧时间的延长而增加；三七总皂苷能降低神经细胞凋亡及坏死的百分率，降低细胞内Ca2＋浓度，减少乳酸脱氢酶的释放，且其作用随剂量增加而增强。Shih等［3］发现，川芎提取物川芎嗪可以保护原代培养的大鼠海马神经元线粒体，减少自由基的产生并帮助清除自由基，从而对红藻氨酸所致的细胞损伤起到保护作用。刘晓玲等［4］原代培养大鼠滑膜细胞，发现青藤碱可以通过抑制滑膜细胞恶性增殖及白细胞介素6 mRNA基因的表达来阻断滑膜炎的进程。林爱华等［5］报道，粉防己碱可以明显抑制气道平滑肌细胞的增殖活性。粉防己碱对组胺激发的［Ca2＋］ i升高表现出明显的抑制效应，推测粉防己碱抑制培养的气道平滑肌细胞增殖活性的作用可能是通过阻断细胞膜Ca2+通道而降低［Ca2＋］ i实现的。Bickmeyer等［6］研究报道，粉防己碱可以阻滞原代培养的牛嗜铬细胞电压依赖式钙离子通道，促进儿茶酚胺释放，增加细胞内钙离子的水平。崔云华等［7］原代培养大鼠肝星状细胞，发现丹参酸乙可降低活化的以及经丙二醛刺激后的肝星状细胞内的氧化程度、抑制增殖细胞核抗原的表达量，在抗氧化和抗增殖作用之间可能存在一定的联系。Li等［8］原代培养中脑神经元及神经胶质细胞，发现雷公藤提取物雷公藤内酯可以对抗脂多糖所致的多巴胺吸收减少和细胞中酪氨酸羟化酶免疫活性的丢失、抑制小神经胶质细胞的活动和肿瘤坏死因子α及一氧化氮的过度生成。雷公藤内酯还可保护脂多糖所致的多巴胺能神经元的损伤，其机制可能是抑制小神经胶质细胞的活动。Kamei等［9］采用原代培养技术培养大鼠脂肪细胞和心肌细胞，首次证实中药提取物紫草素在体外实验中具有胰岛素样作用。Hsu等［10］采用原代培养技术培养嗜中性粒细胞，发现灵芝多糖可促进嗜中性粒细胞的移动，增强蛋白激酶C、丝裂酶原激活蛋白激酶和酪氨酸激酶的活性，从而增强嗜中性粒细胞的趋化性和吞噬作用。Wang等［11］报道，从白术中提取的有效成分苍术酮对原代培养的人白血病单核细胞有一定的细胞毒性。 万文成等［12］发现清开灵能减少谷氨酸所致的原代培养大鼠大脑皮层神经细胞内乳酸脱氢酶的漏出量、减轻细胞的形态学改变，表明清开灵能够对抗谷氨酸介导的兴奋性毒性，对培养的大鼠皮层脑细胞具有保护作用。李彧等［13］原代培养大鼠系膜细胞，经脂多糖刺激10 h后，核转录因子-κB的活性达到最高峰，且最高荧光强度位于细胞核内；大剂量温脾汤药物血清可明显抑制核转录因子-κB的活性；大剂量药物血清能明显抑制核转录因子-κB抑制剂IκB的降解。李彤等［14］采用血清药理学方法及原代培养心肌细胞技术，发现在通脉汤含药血清干预下，缺氧心肌细胞游离钙离子的浓度明显下降，同时细胞膜L型钙离子通道的表达在缺氧条件下亦明显下降，表明通脉汤可以减轻缺氧心肌细胞钙的超负荷。尤红等［15］的实验结果显示，一定浓度的复方861（由丹参、黄芪等十味中药组成）可以促进体外分离培养的大鼠肝细胞DNA的合成，对肝细胞的凋亡则无明显影响。张斌等［16］观察抗纤复方对大鼠纤维化肝原代培养贮脂细胞自分泌的影响，结果表明抗纤复方药物血清能明显抑制贮脂细胞产生转化生长因子β1，阻断肝纤维化时贮脂细胞的自分泌。Imanishi等［17］采用原代培养技术培养肝星状细胞，并用硫代乙酰胺造成肝纤维化模型。结果表明，茵陈蒿汤主要是通过抑制血小板源生长因子b受体的磷酸化及下行信号传导通路来抑制DNA的合成与转录，可能是茵陈蒿汤治疗肝纤维化的机制。Zhang等［18］原代培养胎鼠皮层神经细胞，用谷氨酸盐造成细胞损伤，使细胞中胆碱酯酶和链亲合素标记的过氧化物酶活性降低、乳酸脱氢酶释放增加。加入清脑益智方药物血清后，上述酶的活性可恢复至正常水平，一氧化氮的生成及细胞凋亡亦受到抑制。2.1.2 用于方剂配伍机制的研究 刘成海等［19］将扶正化瘀319方进行拆方，各自制备药物血清并作用于原代培养肝细胞。结果显示，各药物血清对细胞形态无明显影响，对肝细胞白蛋白分泌及其前白蛋白原mRNA表达则有不同程度的促进作用，其中尤以扶正化瘀319方全方的作用最为显著。2.2 用于针灸学研究 梁希彬等［20］观察电针后大鼠中脑腹侧部粗提液对体外培养多巴胺能神经元表达数目、神经元胞体直径及神经突起长度的影响。实验证实，电针后大鼠中脑腹侧部粗提液能够促进多巴胺能神经元胞体的发育和突起的生长，但对多巴胺能神经元表达数目则无明显影响。2.3 用于中医证候本质的研究 陈云波等［21］采用血瘀证兔模型血管内皮细胞直接培养以及血瘀证兔模型血清培养血管内皮细胞两种方法，建立血瘀证细胞损伤模型。原代培养的血管内皮细胞出现了病理性损伤及内分泌功能的改变。此外，模型组原代细胞培养液中一氧化氮的含量比对照组明显减少，而内皮素含量则有上升趋势。证明实验建立的细胞损伤模型从功能和结构上能反映血瘀证整体动物模型及部分临床病人的病理特征，可用于血瘀证实质和活血化瘀作用机制的研究。3 原代培养技术应用于中医药研究存在的问题及前景3.1 加强相关的基础研究 原代培养经首次传代成功即成细胞系，通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定、生物性状较为明确的细胞群。细胞系分裂繁殖过程中形成单层有利于培养，细胞亦可冻存，以备以后的培养。一般来说，细胞系优于原代培养。细胞系在中医药研究中已被广泛应用，如各种肿瘤细胞、肝星状细胞系、巨嗜细胞系、经乙肝病毒基因转染的肝细胞等，主要用于中药的药效学研究。但毕竟还有许多细胞尚无法获得细胞系（株），尤其在现阶段的中国，稳定的细胞系、细胞株不易获得，原代培养细胞至少提供了体外细胞水平实验的工具。因此，须加强细胞培养的基础研究，将更多的细胞系（株）应用于中医药研究领域，使中医药研究在细胞水平上有所提高。 目前，国内外已有许多取材于人的细胞培养研究，其细胞多取材于器官捐献者。国内在此方面的研究工作开展较少，在中医药领域中的研究才刚刚开始。由于存在伦理学等方面因素的制约，其应用范围仍然较窄，目前主要用于一些比较容易获得的细胞，如子宫内膜细胞、人牙髓细胞、角质细胞（来源于手术切除的包皮）、血细胞及血管内皮细胞（来源于脐带）等，还有一些来源于手术切除的细胞，如肿瘤细胞及腹主动脉瘤血管平滑肌细胞等。 细胞培养技术研究中药时的一个关键技术是中药的给药方法，关于这方面的基础研究正日益受到重视。目前在中药药效学研究中主要存在两种给药方式：（1）直接添加法。将中药复方以水煎醇提等方法进行粗提，直接添加于培养体系，或将粗提物冷冻干燥，再用培养液稀释后添加于培养体系。该方法简便，但易受制剂的杂质、pH值、渗透压、电解质等因素影响。国内外相关研究中已有使用中药有效成分进行直接添加的实验报道。（2）间接添加法（血清药理学方法）。给予动物复方灌胃给药，收集服药后的动物血清，将含药血清添加于培养细胞。该法避免了体外用药的一些干扰因素，但起步较晚，尚有待进一步完善。3.2 用于中医理论的研究 细胞培养技术在中医药研究中主要用于中药尤其是药效学的研究，并已取得不少成果。迄今为止，研究目的多限于验证临床有效复方或探索其可能的作用机制，但这显然是不够的。应充分发挥体外实验的优势，深入研究中药复方在组方、剂量、辨证论治上的奥妙，进而推陈出新，给临床以启示或指导［22］，这对于开发中药、推进中医药走向世界有重要意义。 此外，运用细胞培养技术阐明中医理论的实质亦是值得探索的领域。如吴正正等［23］提出中医“证”（虚证和部分实证）的本质是细胞内基因诱生性表达的细胞因子。中医“证”发生的分子机制是由于细胞因子网络自稳态平衡破坏的结果。阴虚证的本质可能是由于白细胞介素1和肿瘤坏死因子基因表达增强、生物学活性相对升高，引起细胞因子网络自稳态平衡失调的结果。现已有一些研究证候实质的实验，如血瘀证血管内皮细胞病理模型的建立及其相关研究。郑爱华等［24］探讨了肝郁证、脾虚证模型动物干扰素γ及白细胞介素4 mRNA表达的变化。由于传统中医理论比较重视整体而忽视微观的原因，因而从细胞、分子水平来研究中医基础理论的工作目前还相对较少，利用细胞培养技术深入进行这方面的研究，可以促进中医基础理论研究的进一步发展。

为什么说间充质干细胞很有存储的价值？在哪儿存比较好？

1、干细胞哪里来？

干细胞来源于人体的很多部位，以间充质干细胞为例，它可以来源于骨髓、脐带、胎盘，也可以来源于脂肪。我们现在最熟悉的储存方式，就是储存新生儿脐带、胎盘中的间充质干细胞。

研究发现，新生儿出生后带来的脐带胎盘中有非常丰富的干细胞。譬如，来自脐带的干细胞占5%到10%，主要是间充质干细胞；而来自胎盘的干细胞占约90%，包含大量的造血干细胞和丰富的间充质干细胞。而且，使用和提取干细胞对新生儿和妈妈都没有任何伤害，并且在用于干预各类难治重病时，有非常好的效果和潜力，因此也被称为人体的备份器！

2、储存干细胞有什么用？

间充质干细胞是目前医学界采用率很高的疾病治疗的 “原材料”，在抗衰老、提高健康水平、免疫调节、组织器官修复、再生医学以及未来应对各类难治疾病方向都有很大应用潜力。

目前，全球已批准了10多个干细胞药物上市，大部分都是与间充质干细胞相关。此外，关于干细胞的临床研究涉及上百种疾病，譬如干细胞干预骨关节病、糖尿病、帕金森症、视网膜病变、心脑血管疾病等。

3、如何选择靠谱的储存机构？

由于胎盘、脐带中干细胞的存储环境关系到宝宝及家人一生的健康，在选择干细胞存储机构的时候，一定要选择有核心细胞技术专利、权威认证的、“产学研”一体化的机构进行存储。并且干细胞对于其赖以生存的环境也有特殊的高要求、高标准。比如，采集的干细胞样本必须存放在无菌、特制的保温容器内，在特定的温度、条件下运输，才能保证种子细胞的活性；制备时对实验室的环境和实验员的技术有严苛的要求。这些细节都关乎着干细胞储存的品质。

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