间充质细胞标志物（间充质细胞位于哪里）

本文的目的是仔细研究间充质细胞标志物和间充质细胞位于哪里这两个概念，帮助你理解它们之间的关系。

mesenchymal stem cell的标志物有哪些

干细胞（stem cell）是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可以分化产生一种以上的“专业” 细胞。按照干细胞的生存阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。研究发现，成体干细胞可以横向分化为其它类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。按照干细胞的分化潜能可将其分为全能干细胞（totipotent stem cell）、多能干细胞（pluripotent stem cell）、专能干细胞{multipotent stem cell}以及单能干细胞（unipotent stem cell）。所谓全能干细胞是具有受精卵全能性的细胞，可分化为胚胎和胎盘的滋养层细胞，进一步分化形成一个完整的个体。在人的发育过程中，精卵受精后产生了一个单细胞的受精卵，受精卵经几次分裂发育成相同的全能细胞（totipotent cells），其中每一个细胞都可以发育成一完整的人体；多能干细胞是受精9天后，这些细胞经数次分裂发育成囊胚，囊胚具有外层细胞和内细胞团（inner cell mass，ICM），外层细胞形成胎盘和支持组织，内细胞团可以分化成三个胚层，即可形成各器官系统。虽然内细胞团可以形成每一中组织, 但它不能形成完整的胎儿，因为它不能形成胎盘和支持组织。这类内细胞团称为多能干细胞；多能干细胞进一步特化产生具有特殊功能的细胞群体，即专能干细胞，专能干细胞分化潜能较之多能干细胞分化潜能低，但也具有多项分化功能，如造血干细胞分裂分化产生红细胞、白细胞、血小板，皮肤干细胞产生各种类型的皮肤细胞；单能干细胞分化潜能最差，仅能产生一种类型细胞，例如表皮干细胞（epidermal stem cell）和睾丸中的精原干细胞（spermatogonial stem cell）。

干细胞的特点包括：①干细胞本身不是处于分化途径的终端，具有多项分化的能力；②干细胞具有无限的增殖分裂能力，能够进行自我更新；③干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。

一、干细胞的形态和生化特征

干细胞为圆形或椭圆形，体积较小，核质比相对较大。均具有较高的端粒酶（telomerase）活性。不同的干细胞具有不同的生化标志，这对于确定干细胞的位置、寻找、分离和鉴定干细胞有重要意义。然而，干细胞的生存环境可影响其形态和生化特征，因此不能仅根据干细胞的形态和生化特征来寻找干细胞。具有增殖和自我更新能力以及在适当条件下表现出一定的分化潜能才是干细胞的本质特征。

一般而言，干细胞是相对未分化的细胞，在大多数组织中不具备其后代分化细胞的特殊功能。现已发现干细胞存在于多种器官组织中，但目前尚未发现心脏中存在干细胞。

二、细胞的增殖特性

（一）干细胞增殖的缓慢性

干细胞具有无限的增殖分裂能力。但是干细胞分裂较慢，这有利于其对特定的外界信号做出反应，以决定是进入增殖还是进入分化程序，同时有利于减少干细胞内基因突变的危险。实际上，在干细胞进行分化的时候，干细胞并非直接分化成为有功能的分化细胞，其必须经过一个快速的增殖期，产生过渡放大细胞（transit amplifying cell），又称快速自我更新细胞（rapidly self-renewing cells, RS cells）。过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，过渡放大细胞分裂较快，经若干次分裂后产生分化细胞，其作用是可以通过较少的干细胞产生较多的分化细胞。

（二）干细胞增殖自稳定性

生物体器官组织的自我更新必须通过干细胞的增殖来完成。对于许多干细胞而言，其寿命可伴随生物体个体发育整个过程。在生物体个体发育的漫长的一生中，干细胞不断自我更新并可维持自身数目恒定，这就是干细胞的自稳定性（self-maintenance），这是干细胞的基本特征之一。干细胞通过两种分裂方式来维持其自稳定性，即对称分裂和不对称分裂。

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iPS细胞是什么？有什么用？

专业的医学解读是：iPS 细胞的标准名称，叫“人工多功能性干细胞”，这种多能干细胞，是指体细胞在导入多能遗传基因，以及其他诱导因子的作用下进行基因的重新编排，从而得到拥有与胚胎干细胞相似的分化潜力的干细胞。

这些医学概念听起来有点玄乎，不好理解。我们说得直白一点，就是iPS细胞也属于干细胞的一种，但是属于高级版，因为通过基因的重新编排，这种细胞具有跟你生下来时带有的胚胎干细胞相似的分化潜能，并能产生出一种诱导性，可以进行定向的干细胞治疗。理论上来说，使用iPS 细胞可以再造人体器官，补充、修复人体受损器官和组织。譬如说，你的肾脏坏了，你可以使用自身细胞培植出来的iPS细胞再造一个肾脏换上去，而不需要等着别人捐给你。比如，你发现自己脸上有了皱纹，那就用iPS细胞修复自己的肌肤，让60岁的老太太变成18岁的小姑娘。

以上内容参考徐静波《日本的底力》

RNA m6A甲基化通过Hippo途径促进肝癌血管生成拟态的形成

前言

肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在世界范围内发病率排名第六。肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的大多数。虽然近年来HCC的治疗取得了很大进展，但HCC患者的预后仍然很差。血管生成对促进肝细胞癌的生长和转移至关重要。既往研究表明，肿瘤中的血管仅由内皮细胞形成。自上世纪90年代，许多制药公司集中精力开发抑制血管生成的化合物，以“饿死肿瘤细胞”。一些药物，如Avastin和Nexavar，已被美国批准用于癌症治疗。然而，这些药物只是暂时减缓肿瘤的生长，而且不能完全杀死肿瘤细胞。此外，许多用这些药物治疗的肿瘤往往产生耐药性或转移。1999年，Maniotis发现了血管生成拟态（Vasculogenic mimicry, VM）。他认为，肿瘤中有功能的血供通道可能与内皮细胞无关，而是由侵袭性肿瘤细胞形成的。这一发现为肿瘤的血液供应提供了一个新的视角。到目前为止，VM存在于多种癌症类型中，如黑色素瘤、卵巢癌、结直肠癌、喉部鳞状细胞癌、HCC等，并与患者预后不良有关。VM是由侵袭性肿瘤细胞形成的模拟血管生成网络，在肝细胞癌的恶性肿瘤中起重要作用。然而，VM的发病机制是复杂的，并没有完全明确。N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最丰富的可逆甲基化修饰。近年来，许多研究集中在m6a修饰的mRNA的生物学功能上。m6A修饰被发现参与多种生物学过程，并在癌症进展中发挥重要作用。然而，m6A与VM形成之间的关系尚不清楚。

研究结果

➀ 临床HCC组织中METTL3的表达与VM及患者预后不良有关

作者利用CD34或CD31和periodic acid–Schiff  (PAS)双重染色来区分基质VM的形态模式特征。首先，对75例HCC患者进行了回顾性研究。CD31-PAS双染色和IHC染色后，根据VM的数量及METTL3染色强度将病理组分为4个亚组:VM + /METTL3 +，VM−/METTL3 +，VM + /METTL3−和VM−/METTL3−。生存分析显示，双阳性组的存活率明显低于双阴性组。且METTL3染色强度与VM的数量也呈正相关。并对96例HCC患者进行了共表达分析。作责发现METTL3与上皮标志物E-cadherin的表达呈负相关，与VM标志物VE-cadherin、VEGFR1和VEGFR2（补充数据），间充质细胞标志物Vimentin，肿瘤VM微环境标志物，MMP2和MMP9呈正相关。此外，TCGA数据显示METTL3在364例肝癌患者中的表达与VM相关蛋白，CDH5、VIM、FLT1、KDR、MMP2、MMP9、FN1和SERPINE2呈正相关。另外，根据METTL3 mRNA表达情况将患者分为两组，即：METTL3高表达组和METTL3低表达组，两组之间的差异基因使用GSEA富集寻找METTL3相关通路。VEGFa信号通路被显著富集。这些数据表明，METTL3参与了肝细胞癌VM的形成且与预后不良密切相关。

➁ VM的形成受mRNA的m6A水平的调控

接下来，进一步探究m6A修饰与VM形成的关系。虽然多种细胞外配体和微环境可以诱导VM，但VEGFa被认为是HCC细胞中这一过程的主要诱导物。作者用VEGFa处理3D培养的HepG2和MHCC-97H细胞后，发现细胞成管能力明显提高，并且m6A / mRNA水平显著上升。同时，利用METTL3的siRNA降低m6A水平后，细胞成管下降能力，VE-cadherin表达受抑制，E-cadherin表达增加；而且，回复了VEGFa诱导E-cadherin下调和VE-cadherin上调。在细胞中过表达ALKBH5 (m6A去甲基化酶)后，m6A水平明显低于对照细胞，且成管能力较弱。以上数据表明，mRNA的m6A水平可能在体外调节肝细胞癌中VM的形成。

➂  Hippo通路参与m6A依赖性VM的形成

在明确了VM的形成受mRNA的m6A水平的调控后，作者进一步探索其机制。RNA-seq分析siNC组和siMETTL3组（3D培养后）的转录组差异，共鉴定出149个差异表达基因。将这些差异基因与GSE110320中m6A修饰的基因进行重叠，我们发现大部分（75%）差异基因的mRNA被m6A修饰。GO分析重叠基因，在癌症的恶性发展中起重要作用的Hippo 信号通路被富集。MeRIP数据的分析结果表明，在YAP1 mRNA中，m6A修饰的丰度较高，特别是在CDS区域。并且，MeRIP-qPCR结果显示，在敲除METTL3细胞中，YAP1 mRNA的m6A修饰水平显著降低。

➃  YAP1在体外通过m6A依赖方式促进VM的形成和癌症进展

接下来，作者进一步分析YAP1参与VM形成及其与m6A的关系。首先，通过WB检测了YAP1的表达，YAP1在使用siRNA敲降METTL3水平后表达下调，在过表达ALKBH5及VEGFa诱导后上调。此外，过表达YAP1可显著促进VM标记物VE-cadherin的表达，降低上皮标记物E-cadherin的表达；下调METTL3可显著挽救因YAP1过表达引起的VE-cadherin水平升高；并且YAP1显著增加VM的形成及增强细胞迁移和侵袭，而同时敲降METTL3后，细胞功能得以恢复。综上所述，YAP1在体外通过m6A依赖的方式促进VM的形成和肿瘤进展。

➄  m6A提高了YAP1 mRNA的翻译效率

前面发现YAP1的表达受到m6A水平的调控，那么，m6A修饰如何调控YAP1的表达呢？作者随后进一步研究了m6A甲基化调控YAP1表达的机制。敲降METTL3后，检测YAP1的pre-mRNA和mRNA表达水平，令人惊讶的是，干扰METTL3后YAP1的转录水平升高。然后我们用actinomycin-D（放线菌素）对细胞进行转录阻断。结果表明，METTL3干扰后，pre-mRNA和mRNA的半衰期明显延长。YAP1 mRNA水平与蛋白水平的不同步使作者怀疑m6A修饰可能与YAP1蛋白的翻译或稳定性有关。接着，用蛋白翻译抑制剂cycloheximide（环己酰亚胺）处理METTL3敲低细胞和相应的对照细胞。WB检测结果显示，两组实验蛋白的半衰期无明显变化。进一步采用双荧光素酶法测定YAP1蛋白的翻译效率，敲除METTL3后，YAP1蛋白的翻译效率显著降低。提示m6A诱导的YAP1表达与蛋白翻译的调控有关。用蔗糖密度梯度差速离心分离HepG2的总RNA，作者分析核糖体图谱，实验结果发现核糖体翻译起始复合物组装的显著减少，并且qPCR检测显示，siMETTL3细胞翻译激活多聚体状态下YAP1的mRNA水平明显降低。综上所述，m6A主要通过影响翻译效率来改变YAP1蛋白的表达。

➅  沉默METTL3可抑制肝细胞癌原位移植肿瘤模型中VM的形成和肿瘤进展

体外机制探明后，作者接着采用原位肝癌移植肿瘤模型，研究m6A甲基化在肝癌转移和体内VM形成过程中的潜在影响。首先，将表达有sh-contorl和sh-METTL3 的SK-Hep1-Luc 细胞注射到裸鼠肝脏中。结果发现，在shMETTL3组，裸鼠全身和肺组织的荧光素酶信号受到抑制；Kaplan-Meier生存分析显示sh-METTL3裸鼠预后良好。并且，裸鼠shMETTL3的肿瘤病灶和VM计数显著低于对照小鼠。免疫组化染色分析显示在shMETTL3组，VM标记物VE-cadherin和其他参与VM 的蛋白MMP2，MMP9，Fibronectin的表达水平下降，同时，YAP1的表达也被抑制，而E-cadherin表达上升。综上所述，m6A甲基化在体内可促进肿瘤进展和VM的形成。

➆  m6A依赖性的YAP1表达在DEN诱导的Mettl3+/−肝癌小鼠模型中促进VM形成和肿瘤转移

为了进一步研究m6A和YAP1在体内癌症进展和VM形成中的作用，作者使用CRISPR-Cas9系统构建了Mettl3+/−C57BL6/J小鼠（敲除METTL3对胚胎是致命的，敲除了一个等位基因），可以发现，METTL3在小鼠肝组织中显著下调。随后，作者使用DEN（二乙基亚硝胺）处理小鼠，诱导HCC模型。造模成功后，一半的Mettl3+/−小鼠接受了治疗，将YAP1质粒注射入尾静脉即Mettl3+/−+ YAP1组，另一半Mettl3+/−小鼠用对照质粒，Mettl3+/−+Vector组，野生型老鼠用对照质粒，Wt + Vector组。实验结果发现Mettl3+/−+Vector组小鼠肿瘤病灶明显少于Wt +Vector组，而接受YAP1质粒注射后，减少的肿瘤病灶明显恢复。肺转移病灶及VM检测结果与此类似，相比于Wt +Vector组，Mettl3+/−+Vector组肺转移病灶及VM数量明显减少，而在接受YAP1质粒注射后，被恢复。免疫组化染色分析显示VE-cadherin，MMP2和MMP9的表达在Mettl3+/−+Vector小鼠中下降，而过表达YAP1挽救了敲除METTL3的影响。这些数据表明，在DEN诱导的Mettl3+/−肝癌小鼠模型中，敲除METTL3可以减弱其对癌症进展及VM形成的影响，而YAP1恢复了敲除METTL3的影响。

总结

在本研究中，作者发现m6A 甲基化酶 METTL3在HCC组织中的表达与VM呈正相关。VEGFa处理的3D培养细胞中m6A mRNA水平升高，与VM的形成及VM相关的标记物有关。RNA测序和功能研究表明Hippo通路参与了m6A介导的VM形成。m6A修饰可以促进YAP1 mRNA的翻译，激活Hippo通路。此外，m6A依赖的YAP1表达在体内外均可促进VM的形成、迁移、侵袭。作者研究结果表明，m6A修饰在HCC中VM的形成中起关键作用。METTL3和YAP1可能通过阻碍VM的形成成为抗转移的潜在治疗靶点。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常 重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术

  一、实验前准备 

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

1. 选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。

3. 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

 二、全骨髓提取  

1. 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

2. 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

3. 用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

  三、细胞制备

吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。

 四、接种培养  

1. 离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm

2. 培养瓶中，轻轻摇匀;置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2饱和湿度培养箱中培养。

3. 24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。

  五、细胞传代

待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

本实验以 1：2 进行传代。

  六、细胞观察 　

细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。

从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。

  七、注意事项   

1. 缓慢冲洗骨髓腔：

冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。

2. 严格无菌：

取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作

3. 培养基中血清浓度：

过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养

4. 原代细胞静置培养：

原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。

大鼠小鼠间充质干细胞区别

MSC的细胞表面标志物鉴定常采用流式细胞仪来进行。MSC属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它可同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。

MSC的细胞表面标志物鉴定标准为：

① CD105、CD73和CD90阳性率≥90%；

② CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR呈阴性，阳性率≤5%。

不同组织来源的MSC可共享相同的细胞表面标记，如CD29和CD44。

03 多向分化潜能鉴定

MSC具有在体外分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞等定向分化的能力，所以鉴定MSC的多向分化潜能也是重要的鉴定方法之一。MSC成骨诱导分化最常用的染色方法是茜素红染色法，成脂诱导分化最常用的染色方法是油红O染色法，而成软骨诱导分化最常用的方法是阿利辛蓝染色、悬浮培养。

骨髓间充质干细胞表面标志物cd45是单标还是双标

不同的干细胞有自己特异的细胞表面抗原，鉴定细胞的种类最准确直接的方法就是用流式细胞仪检测其表面抗原。

以骨髓间充质干细胞（MSC）为例，需要鉴定CD34、CD44、SH1等表面标志。除此之外，骨髓间充质干细胞还需要进行分化实验，以证实其可以分化为骨、软骨、细胞。以上两条，即表面标志及分化实验没有问题，就可以确定培养的细胞为骨髓间充质干细胞。

不同的干细胞有不同的表面标志及分化能力，所以MSC只是做为一个例子来说明。

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