人胚胎干细胞培养基成分（人胚胎干细胞标准具体内容）

我们将涵盖人胚胎干细胞培养基成分和人胚胎干细胞标准具体内容的所有方面，并试图探索两者之间的关系和区别。

ES培养基成分

不同的ES配方多少有些差异.基础培养基一般用DMEM或DF12.（以下为DMEM培养基为例）

1、提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻;

2、在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分(如，丙酮酸钠、抗生素等)，按照比例加入dmem培养基中，作好标签;放入4℃冰箱保存。

ES细胞培养方法：

化冻

将血清(Fetal Bovine Serum，Hyclone)从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜;也可室温(或浸于自来水中)化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存;

灭活

(1) 放入室温的水浴锅内开始加热(同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准);

(2) 当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟;若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短(比如：不超过5分钟)，则仍可使用;若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME

胞的培养;

(2) 取出，自然冷却至室温(约需1-3小时)，可分装或-20℃继续冻存;

分装

(1)转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀;吹出血清时要注意：不要吹出气泡(血清很粘稠，很容易产生气泡;如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下);标好批号和日期;

(2)放入-20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1.取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死;

2.将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫)，剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中;

3. 把平皿转入超净台;

4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次;

6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);

7. 加入适量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520，下同)，体积约等于组织块体积;

8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘)，加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀(5-10次)，静置;

9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。

10. 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);

11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签(ME-0;注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好)，转入培养箱培养;

12. 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次)，若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代(视细胞疏密而定)，放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞(Feeder)的制备

注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)

弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

放入培养箱培养3小时(2-4小时);

用0.1% 明胶处理培养皿(将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;

弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);

加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。

ES细胞的复苏

提前制备好相应数量的Feeder;

准备37-39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管(冻存细胞)，迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化;

转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟;

弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中(冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿)，补加适量培养液;

转入培养箱培养，次日换液;此后每24小时换一次液，每48小时传一次代(视生长情况)。

ES细胞的换液

1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内)；

2.细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察(判断生长情况，并确证未发生污染)后转入无菌操作台内;

3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基(6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基);

4. 放回培养箱继续培养。

ES细胞的传代

前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板;

提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温(或者放于37℃温箱内);

将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出(相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积);ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少;

将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去;再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层(皿底一层白色脏东西样膜)出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打(视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止);平均分到Feeder培养皿中(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来)，滴加补加培养基至5 ml左右(滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来;若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右)，作好标签;

前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。

ES细胞的冻存

常规方法将细胞消化成单细胞悬液;

转入试管，1000转/分钟离心5分钟;

配适量冻存液(为含10% 二甲亚砜(DMSO)，10% FBS的DMEM培养液);

弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液(只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可)，转入冻存管，作好标签;

放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。

高中，生物，胚胎干细胞的培养

肯定不是。

饲养层是一层细胞，用于提供干细胞培养所需的物质（教材中说的很清楚）。

细胞培养液的成分有：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清或血浆.

干细胞相关的培养液都必须在5％CO2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。

胚胎干细胞培养需要什么生长因子？

人胚胎干细胞培养需要加BFGF碱性成纤维细胞因子，小鼠培养干细胞培养需要加入LIF（白血病抑制因子），在此基础上两种胚胎干细胞还需要MEF(小鼠胚胎成纤维细胞）饲养层

求助，有人用无血清培养基养细胞吗

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。无血清培养基的基本配方为基础培养基及添加组分两大部分。 无血清培养基可避免血清批次间的差异影响，提高细胞培养和实验结果的重复性，减少血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。基于无血清培养基以上的优势，ScienCell实验室根据不同细胞的生长特性研发了不同种类的无血清培养基。ScienCell无血清培养基列表如下：

1111 SMCM-sf 平滑肌细胞培养基

1511 NPrCM 神经前体细胞培养基

1521 NM 神经细胞培养基

1601 OPCM 少突胶质前体细胞培养基

1611 OsM 球状少突细胞培养基

2101 KM 角质细胞培养基

2111 KM-d 角质细胞培养基（确定）

2311 FM-sf 成纤维细胞培养基

2561 TEpiCM 扁桃体上皮细胞培养基

2611 OKM 口腔角质细胞培养基

2951 CoEpiCM 结肠上皮细胞培养基

3211 BEpiCM 支气管上皮细胞培养基

3231 SAEpiCM 小气管上皮细胞培养基

4121 EpiCM-2 上皮细胞培养基-2

4321 UCM 尿道上皮细胞培养基

4411 PEpiCM 前列腺上皮细胞培养基

5501 HemGM 造血细胞培养基

5801 STEMium 人胚胎干细胞无血清培养基

5811 STEMium-XF 无异种人胚胎干细胞生长培养基

5881 MEF-cm 小鼠胚胎成纤维细胞培养基

5891 bFGF-std MEF-cm 碱性成纤维细胞生长因子刺激的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基

5911 CSM 心肌细胞选择性培养基

5931 PSCNIM 多功能干细胞神经诱导培养基

6511 CEpiCM 角膜上皮细胞培养基

7311 OEpiCM 卵巢上皮细胞培养基

7511 MSCM-sf 间充质干细胞培养基

7611 MEpiCM 乳腺上皮细胞培养基

细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。

ScienCell无血清培养基，是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质。每套包含500毫升基础液，5毫升细胞生长添加物，5毫升双抗，混匀后即为完全培养基。每一款专用培养基均搭配特定类型的细胞生长添加物成分，为细胞的传代和生长提供最佳环境。

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