骨髓间充质干细胞原代培养（骨髓间充质干细胞原代培养原理）

这篇文章的意图是以一种能够帮助你的方式讨论骨髓间充质干细胞原代培养和骨髓间充质干细胞原代培养原理的知识。

骨髓间充质干细胞可以用DMEM/F12养吗

DMEM-F12是适于各类干细胞培养的基础培养基，按不同目的还需要你补加其它东西。看到丁香园里的很多人都是那这个养BMSC的，应该没问题。

但也有人说DMEM/F12容易导致细胞分化，所以个人建议最好使用低糖培养基。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常 重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术

  一、实验前准备 

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

1. 选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。

3. 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

 二、全骨髓提取  

1. 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

2. 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

3. 用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

  三、细胞制备

吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。

 四、接种培养  

1. 离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm

2. 培养瓶中，轻轻摇匀;置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2饱和湿度培养箱中培养。

3. 24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。

  五、细胞传代

待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

本实验以 1：2 进行传代。

  六、细胞观察 　

细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。

从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。

  七、注意事项   

1. 缓慢冲洗骨髓腔：

冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。

2. 严格无菌：

取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作

3. 培养基中血清浓度：

过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养

4. 原代细胞静置培养：

原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。

如何保存大鼠腿骨组织，取骨过程是否要求绝对严格无菌？准备提取骨髓间充质干细胞进行原代培养。

没那么严格要求的 我们这边有做组织工程的实验室 早上去菜市场还是屠宰场的 买了骨头 然后拿回去取细胞培养都没问题的

请高手解答：骨髓细胞，骨髓干细胞，骨髓造血干细胞，是什么关系？

骨髓细胞，骨髓干细胞，骨髓造血干细胞

由于生理变异和不同的调查资料，正常骨髓象各系统各阶段细胞比值变动范围较大，所以正常骨髓象实际含义是正常范围骨髓象，下降数据可做为骨髓涂片中各种血细胞正常值的参考： 粒细胞系统占比例最大，约1/2强。一般原始粒细胞0.02，早幼粒细胞0.05，以中性杆状核最多，其比值大于分叶核细胞，也多于晚幼粒细胞，嗜酸性粒细胞0.05，嗜碱性粒细胞0.01。 红细胞系统占骨髓第二位（有核红细胞），约占1/5左右，以晚幼红细胞居多，中幼红细胞次之，原始红细胞0.01，早幼红细胞一般0.05，无巨幼红细胞。 淋巴细胞约占1/5左右，小儿偏高，有时可达0.4，单核细胞一般0.04，浆细胞一般小于0.015。 非造血细胞，如网状细胞、吞噬细胞、组织嗜碱性细胞等可少量存在，它们的比值虽然很低，但却骨髓有成份的标志。

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、 肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。

造血干细胞（ Stem cell ，SC）是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。它们具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。但其配型成功率相对较低，且费用高昂。捐献造血干细胞对捐献者的身体并无很大伤害。

为什么说间充质干细胞很有存储的价值？在哪儿存比较好？

1、干细胞哪里来？

干细胞来源于人体的很多部位，以间充质干细胞为例，它可以来源于骨髓、脐带、胎盘，也可以来源于脂肪。我们现在最熟悉的储存方式，就是储存新生儿脐带、胎盘中的间充质干细胞。

研究发现，新生儿出生后带来的脐带胎盘中有非常丰富的干细胞。譬如，来自脐带的干细胞占5%到10%，主要是间充质干细胞；而来自胎盘的干细胞占约90%，包含大量的造血干细胞和丰富的间充质干细胞。而且，使用和提取干细胞对新生儿和妈妈都没有任何伤害，并且在用于干预各类难治重病时，有非常好的效果和潜力，因此也被称为人体的备份器！

2、储存干细胞有什么用？

间充质干细胞是目前医学界采用率很高的疾病治疗的 “原材料”，在抗衰老、提高健康水平、免疫调节、组织器官修复、再生医学以及未来应对各类难治疾病方向都有很大应用潜力。

目前，全球已批准了10多个干细胞药物上市，大部分都是与间充质干细胞相关。此外，关于干细胞的临床研究涉及上百种疾病，譬如干细胞干预骨关节病、糖尿病、帕金森症、视网膜病变、心脑血管疾病等。

3、如何选择靠谱的储存机构？

由于胎盘、脐带中干细胞的存储环境关系到宝宝及家人一生的健康，在选择干细胞存储机构的时候，一定要选择有核心细胞技术专利、权威认证的、“产学研”一体化的机构进行存储。并且干细胞对于其赖以生存的环境也有特殊的高要求、高标准。比如，采集的干细胞样本必须存放在无菌、特制的保温容器内，在特定的温度、条件下运输，才能保证种子细胞的活性；制备时对实验室的环境和实验员的技术有严苛的要求。这些细节都关乎着干细胞储存的品质。

动物细胞传代顺序

动物细胞传代培养的操作步骤

1.观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。

2.加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3.打开超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。

4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5.取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6.用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8.将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。

9.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12.擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。

13.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

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