大鼠间充质干细胞培养基（小鼠间充质干细胞培养）

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大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常 重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术

  一、实验前准备 

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

1. 选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。

3. 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

 二、全骨髓提取  

1. 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

2. 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

3. 用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

  三、细胞制备

吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。

 四、接种培养  

1. 离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm

2. 培养瓶中，轻轻摇匀;置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2饱和湿度培养箱中培养。

3. 24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。

  五、细胞传代

待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

本实验以 1：2 进行传代。

  六、细胞观察 　

细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。

从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。

  七、注意事项   

1. 缓慢冲洗骨髓腔：

冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。

2. 严格无菌：

取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作

3. 培养基中血清浓度：

过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养

4. 原代细胞静置培养：

原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。

大家培养间充质干细胞都用哪家培养基？

间充质干细胞培养基Thermo fisher ,StemCell都有，但价格太贵了，国内的品牌也推荐埃泽思，适合大规模培养。

请教间充质干细胞成脂诱导分化培养基的配制

充质干细胞成脂诱导分化培养基的配制

诱导液？你说的是成骨诱导条件培养基吧。

5天后半量换液，第10天当观察到少量细胞变为梭形、贴壁，即全量换液，改为条件培养基。此后每3-4天换1次条件培养基。倒置显微镜隔日观察，直至细胞不能传代、衰老死亡为止。

下面就是爬片的制作，染色以及结果判定了。

诱导培养基添加必要的成分使组织切块或细胞形成愈伤组织,分化培养基指把促使愈伤组织细胞恢复全能性,可以进行正常的根茎叶的形成

动物细胞培养的常用培养基类型有哪些？各有何特点和用途

动物细胞的培养基的种类和组成 分3类： ⒈天然培养基 ⒉合成培养基 ⒊无血清培养基

天然培养基：

天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限。天然培养基/液的种类很多，包括生物性液体（如血清）；组织浸液（如胚胎浸液）；凝固剂（如血浆）等。如：胎牛血清

合成培养基：

合成培养基（synthetic medium），又称为组合培养基，是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。比如：1640、DMEM

无血清培养基：

无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清培养基含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质和清蛋白，纤维蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同的功能，如提供细胞贴壁所需的基质，抗生物反应器剪切力，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。比如：间充质干细胞无血清培养基

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