骨髓间充质干细胞的分离培养（骨髓间充质干细胞bmsc）

我们还将深入探讨这个问题，以帮助你更好地了解骨髓间充质干细胞的分离培养和骨髓间充质干细胞bmsc。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常 重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术

  一、实验前准备 

实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml 离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射 30min。

1. 选取 SPF 级，体重 100~150g 左右的SD 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作台紫外消毒后，采用通风机通风 3min。以 75%酒精擦拭操作台和双手。

3. 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

 二、全骨髓提取  

1. 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。

2. 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。

3. 用无菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM 完全培养液的无菌培养皿中，取出 1mL 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。

  三、细胞制备

吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于 15 mL 离心管中，1000 r/min 室温离心5 min。

 四、接种培养  

1. 离心后去上清，用 6mL 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至 25 cm

2. 培养瓶中，轻轻摇匀;置于 37 ℃、体积分数为 5%的 CO2饱和湿度培养箱中培养。

3. 24 小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞， 以后每两三天换液 1 次，直到增殖达到融合。4. 约 7 天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达 80%~90%，可进行细胞传代。

  五、细胞传代

待细胞融合至 80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的 PBS 轻轻冲洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA 浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。

本实验以 1：2 进行传代。

  六、细胞观察 　

细胞传代到第 3 代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达 95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34 阴性，CD44 阳性。

从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。

  七、注意事项   

1. 缓慢冲洗骨髓腔：

冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。

2. 严格无菌：

取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作

3. 培养基中血清浓度：

过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培养

4. 原代细胞静置培养：

原代细胞置于培养箱 24～48h 内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。

求助人脐带间充质干细胞提取方法

方法:

无菌条件下截取流产胎儿双侧四肢骨,PBS冲洗髓腔,离心去脂肪及上清液,L-DMEM重悬细胞,沿管壁缓慢滴加至底部有等量1.073 g/mL Percoll分离液的离心管中,离心后吸取中间界面白膜层,加入含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素钠、链霉素的L-DMEM完全培养基,接种后置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内培养.48 h后换液,去除未贴壁细胞,以后每2d换液一次.待细胞达到80%～90%融合时,胰酶-EDTA消化传代.

主要观察指标:

倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞技术检测其表面标记物;碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成软骨分化能力.结果:原代及传代培养的胎儿骨髓间充质干细胞呈梭形外观,具有较强的增殖能力.胞体较小,细胞核/浆比例大,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆少,染色质较疏松,表现出早期细胞的特点,传至第20代细胞超微结构仍无明显改变.细胞表面抗原CD29,CD44,CD105呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达.骨髓间充质干细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原均呈阳性.

结论:

利用密度梯度离心+贴壁筛选法可成功分离培养胎儿骨髓间充质干细胞,所获细胞能够向成骨细胞及软骨细胞分化,该方法为体外培养扩增胎儿骨髓间充质干细胞的简单、稳定、高效的手段.

骨髓干细胞的骨髓间充质干细胞

MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、 肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，越来越受到学者们的青睐，被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。

各位大侠，naive T 细胞的分离

GVHD是同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)后影响预后的 重要并发症。受者预处理造成组织损伤并释放炎性因子(如IFN-γ、IL-2等)引 起GVHD。最近的研究发现骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)不仅可以分化为 多种间充质组织，而且具有支持造血和免疫调节作用，但其机制尚不清楚。目前 的研究认为供者来源的Naive T细胞识别受者主要组织相容性抗原启动了 GVHD。我们将体外新生的Naive T细胞接种于异基因MSCs上，观察MSCs对 Naive T细胞分泌细胞因子的影响，直接研究它对Naive T细胞的作用，将更深入 地揭示其预防GVHD的机制。 材料和方法：

1、 MSCs体外分离培养：将肝素抗凝的骨髓用密度梯度离心 法(过percoll细胞分离液)分离出单个核细胞，体外培养贴壁细胞，传3代后得 到纯度和数量均较高的MSCs，经60Co照射后作为实验细胞。

2、 脐血CD34+细 胞体外分化为Naive T细胞：将胎儿胸腺组织贴壁培养建立胸腺基质细胞培养 (TSC)体系；用单克隆抗体-磁珠分离系统分离纯化脐血CD34+细胞；将CD34+ 细胞植入TSC并添加IL-12、 FL、IL-2，共孵育5周后获取Naive T细胞并通过 流式细胞术鉴定其表型。

3、 MSCs与Naive T细胞共孵育：将体外培养获取的 Naive T细胞种入经照射近融合的MSCs中，对照组为单独MSCs培养和单独Naive T细胞培养。孵育7天后，取上清用ELISA定量检测IL-2、 IFN-γ、IL-4和IL-10， 并应用流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞表型变化 结果：1、 人骨髓来源的MSCs可以在体外培养扩增，用流式细胞术分析传3 代以后的细胞发现它们具有共同的表型CD166+，CD105+， CD45-和CD34-，2、 CD34+细胞可在TSC体系中分化出Naive T细胞，随着培养时间的延长，与体内 胸腺生成T细胞类似，依次出现CD4／8双阴性，双阳性，单阳性细胞。培养第5 周细胞表型测定：CD4+65． 2％，CD8+52． 7％，CD3+78． 8％，CD45RA表达88． 9％。3、 中文摘要 MSCS与NaiveT细胞共孵育七天，镜下观察可见共孵育组T细胞数量轻度增加， 流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞表型显示CDS+细胞相对增加。ELISA检 测上清发现共孵育组IFN一Y分泌减少(p0 .05)，IL一2分泌增加(p0.05)。另 外，在实验组和对照组中均未检测到IL一4、IL一10。 结论:MSCs具有一定的异基因反应性，能刺激NaiveT细胞增生，且MSCs 和NaiveT细胞共孵育组上清中的IL一2分泌增加而IFN一Y分泌减少，提示MSCs 可能借CDS+调节T细胞增生抑制异基因反应性T细胞分泌IFN一Y来发挥免疫调 节作用，本文结果将为进一步阐明MSCs免疫调节机制提供新的线索。

骨髓间充质干细胞的分离培养的介绍就聊到这里吧，感谢你花时间阅读本站内容，更多关于骨髓间充质干细胞bmsc、骨髓间充质干细胞的分离培养的信息别忘了在本站进行查找喔。