造血干细胞集落培养（造血干细胞培育器官）

造血干细胞分化发育成哪些细胞

造血干细胞长期可以自我再生和分化成各类成熟血细胞的干细胞胶囊产品潜能,是什么原因掉头发很厉害血液系统中的成体干细胞,是一个异质性的群体,具有造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下,造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。

造血干细胞可以分化成骨髓干细胞、淋巴系干细胞和多能定向干细胞。骨髓干细胞含有红细胞、巨核细胞以及巨噬细胞的集落(粒、单核系细胞)。淋巴系干细胞是T和B细胞的共同祖先细胞。单能干细胞是一类具有向特定细胞系分化能力的干细胞,也称为祖细胞(progenitor)。如进行体内移植不能形成脾集落,但在一定造血因子的存在下,可在体外培养并形成细胞集落,含有成熟子代细胞。

造血干细胞体外集落形成实验

搬运自：知乎 权威的中科博生

目的：验证造血干细胞的 多向分化潜能 。在文献中有用到。doi: 10.1186/s13287-018-0926-x

这些方法虽然均有其局限性而不能完全代表造血干细胞，但在造血干细胞的研究，尤其是人造血干细胞和早期祖细胞的研究中仍具有重要的意义。

目前用来检测造血干细胞和早期祖细胞的体外克隆实验包括长期培养启动细胞(LTC-IC)和延长的长期培养启动细胞(extended long-term culture initiating cell,ELTC-IC)测试、高增殖潜能集落形成细胞(high proliferative potential colony form-ing cell, HPP-CFC)测试、卵石样区域形成细胞(cobblestone area-forming cell,CAFC)测试、原始细胞集落(colony forming unit-blast, CFU-Blast)测试、CFU-A(colony forming unit type A)实验、混合集落(colony forming unit-mix,CFU-Mix 或

colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte, CFU-GEMM)培养法及二次再克隆实验(secondary recloning assay)等。中科博生。

（1）长期培养启动细胞和延长的长期培养启动细胞测试

在受照射 骨髓基质细胞 的支持下生长35〜60d所产生的集落被称为长期培养启动细胞(LTC-IC),生长60〜100d的被称为延长的长期培养启动细胞(ELTC-IC) O LTC-IC是反映造血干细胞功能的指标，其原理主要是根据绝大多数祖细胞寿命有限，在长期培养体系中向终末细胞分化而失去集落形成能力，或出现凋亡现象，而具备自我更新能力的细胞则能维系其低分化特性因而长期存活。

迄今为止，ELTC-IC和LTC-IC代表了体外培养中最幼稚的造血细胞。它们从增殖分化到形成集落所需的时间比各种集落形成细胞(包括HPP-CFC、CFU-GEMM,CFU-GM.BFU-E.CFU-E等)要长得多，因而比它们更原始。将这种细胞种植到受照射骨髓基质上能维持数周或数月的造血。用5-FU处理的小鼠骨髓细胞，其中无CFU-S12,有在骨髓基质上启动长期造血的能力，而高度纯化的CFU-S12不能在基质上维持长期造血，这说明LTC-IC是比CFU-S12更早的干细胞。LTC-IC虽然不能代表真正的干细胞，但的确可反映干细胞的存在和变化，这已被大家公认。中科博生。

（2）高增殖潜能集落形成细胞测试

Bradley和Hodgson首先发现，骨1M细胞在多种造血因子存在时能在体外半固体培养10〜12d后形成大集落(直径＞0.5mm，约5X 104个细胞)。他们把骨髓中能形成这种大集落的细胞称为高増殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)。集落培养时间随种属不同而异，小瓯为14d,人为21~28d。中科博生。

HPP-CFC具有如下特点：

①在体内对细胞毒药物5-FU不敏感；

②具有向髄系和淋巴系分化的潜能；

③对多种细胞因子(如GM-CSF, CSF-1、IL-1, IL-3、IL-4, IL-6)有反应性；

④同受致死剂量射线照射小鼠造血的重建密切相关。中科博生。

目前HPP-CFC被分成HPP-CFC-1 x HPP-CFC-2、HPP-CFC-3三群。HPP-CFC-1是高度静息的细胞群，与pre-CFU-S密切相关，通常认为比CFU-A更早，但比LTRC更成熟，相当于第28天的CAFC和MRAo HPP-CFC-2与定向祖细胞更接近，HPP-CFC-3则更成熟。人骨髄晚期HPP-CFC形成宣径约0.5 —1mm的集落，早期HPP-CFC形成直径约1~2mm的集落，有的可达2.5〜5mm。中科博生。

（3）卵石样区域形成细胞测试

CAFC是一种基于Dexter体系的微型基质依赖骨髓培养法，它是将骨髓细胞接种于受致死剂量射线照射的基质细胞层上培养10〜28d,观察卵石样血岛形成情况。CAFC在分化程度上同 MRA 和CFC-Blast及原始 HPP-CFC相当，比LTRC成熟。中科博生。

（4）原始细胞集落实验

CFU-Blast是早期的造血细胞(CFC-Blast)在体外适当的条件下半固体培养18〜32d后，形成的由形态上未分化的细胞组成的小集落(＞25个细胞)。这种形态上未分化的细胞具有高度再克隆能力和自我更新潜能，并有产生多系定向祖细胞的能力，在分化程度上相当于HPP-CFC或更早。中科博生。

（5）CFU-A 实验

这是在体外用半固体培养法检测小鼠骨髓造血干细胞的方法。小鼠骨髓细胞在L929和AF1-19T条件培养液刺激下，在体外培养lid可形成直径＞2mm的集落。人骨髓细胞在CSF-1和GM-CSF存在下培养23d后形成直径＞imm的CFU-AO CFU-A为不均一的细胞群体，在分化程度上，CFU-A比LTRC和HPP-CFC更成熟，较早期的CFU-A相当于HPP-CFC-1。中科博生。

（6）体外混合集落培养

CFU-Mix是半固体培养12〜16d后形成的含有粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核多系血细胞的集落。这些细胞大致相当于较晚期的CFU-S,比LTRC成熟。中科博生。

（7）二次再克隆实验

将造血干细胞先在适宜的条件下进行培养后再检测这些培养后的细胞是否具有集落形成能力。利用该实验通常可以观察造血干细胞的自我复制能力及向祖细胞分化的能力。中科博生。

虽然各种体外实验可以部分反映造血干细胞的情况，但值得注意的是，当前的各种体外检测方法均无法观察造血干细胞向淋巴系的分化，即无法判断这些细胞是否具有全系造血能力，因此，迄今为止仍没有一个体外培养方法可用于检测造血干细胞

为什么我培养的骨髓造血细胞没有形成集落

首先半固体培养基不用换液，14-16天后观察集落即可。但是你暨大干细胞在哪里查防伪要在你的培养皿或孔板周围加点水以防止培养基干掉。

现在你的培养基一是可能浓度不对，二是可能因子加得不够，这都是形成不了集落的原因。就加GM-CSF形成不了集落是正常的。做造血干细胞集落分析是要用很多因子的而且都不便宜。你要是实验室没有足够的因子并且又觉得麻烦的话还是买个什莫都加好的成品吧。这样只需要往里加个细胞就OK了发文章也不会受到质疑。