28种免疫细胞基因集在哪下载（免疫基因数据库）

熟悉的肿瘤免疫微环境分析，深入探究乳腺癌亚型的免疫差异

An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment

一种由独特的肿瘤免疫微环境定义的独立贫血亚型乳腺癌

发表期刊：Nat Commun

发表日期：2019 Dec 3

影响因子：12.121

DOI:  10.1038/s41467-019-13329-5

一、研究背景

肿瘤微环境影响癌症的起始和进展。在乳腺癌中，临床病理特征，如年龄，等级，阶段和分子亚型与预后有关，并驱动治疗决策。5种临床相关的分子亚型：Luminal A、Luminal B、Her2富集型、基底样型和正常样型，其发病率、生存率、预后和肿瘤生物学特性各不相同。

除了癌细胞生物学因素外，炎症微环境也影响着肿瘤的起始和进展。癌细胞周围的免疫微环境可以识别和抑制肿瘤生长或促进进展。在乳腺癌中，高免疫浸润已与更好的临床结果。此外，高免疫浸润已与新辅助和辅助化疗的反应增加相关。

二、材料与方法

  1   数据来源

1）基因表达：手术收集的MicMa队列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96，FFPE），MicMa-Agilent（n=104，新鲜冷冻组织））

2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0队列（GSE135298，原始数据在EGAS00001003631）

3）公开的数据：表达数据从GEO、European Genome-phenome Archive、ArrayExpress或TCGA获得；METABRIC队列

  2   分析流程

1）基因集富集分析

2）无监督聚类获得免疫簇：基于509个基因，使用R包pheatmap对患者的相关性矩阵进行层次聚类

3）Nanodissect：用于淋巴和髓细胞浸润的预测，淋巴细胞或骨髓细胞浸润的nanodissect分数反映了样本中各自基因的平均表达量

4）CIBERSORT（22种类型的浸润性免疫细胞的绝对比例）、ssGSEA（上皮间质转化、干细胞、增殖和细胞周期相关途径的基因集）

5）二项式逻辑回归预测免疫集群：R包glmnet （构建模型公式）

6）免疫浸润的病理评估

7）ROR评分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched − 0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中，基底、Her2富集、管腔A和管腔B是每个样本与R中使用genefu软件包获得的质心的相关性

8）统计学、生存分析、多变量Cox回归分析

三、结果展示

01 - 乳腺癌的免疫簇并反映了逐渐的免疫浸润

测量了MicMa队列的95个肿瘤样本中760个基因的表达，该阵列旨在剖析实体肿瘤中的免疫浸润。这95个样本中的79个样本之前已经通过Agilent全基因组4×44K寡核阵列进行了剖析。首先使用Pearson和Spearman相关性比较了两个平台获得的表达，发现基因的表达值之间存在高度的正相关（补充图1A）。

为了根据免疫相关基因表达的相似性对患者进行分组，对相关矩阵进行了无监督的分层聚类（图1a和补充图1B）。从3到10个聚类的轮廓图分析表明，3个聚类最好地捕获了nCounter和Agilent数据集的分割（补充图1C，D）。比较了两个数据集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚类结果。在这两个数据集中，有79个样本是重叠的。随着用于测量基因表达的不同平台，以及基因列表和用于执行无监督聚类的样本的不完全重叠，仍然发现79个重叠样本的聚类分配显著相似。

为了确认集群与肿瘤免疫微环境相关（图1b），使用算法Nanodissect为总淋巴细胞和骨髓细胞浸润打分。Nanodissect评分首先在MicMa队列中使用有经验的病理学家分析的匹配苏木精和曙红切片的免疫浸润评估进行验证（图1c和补充图1E）。发现这三个簇与Nanodissect淋巴细胞（图1b）和骨髓细胞（补充图1F）评分显著相关。得出结论，簇A-C反映了逐渐的免疫浸润，因此被称为免疫簇。

使用其他去美国冻干细胞多少钱9个队列的表达数据验证了这些簇与淋巴/髓细胞浸润之间的关联。有509个基因在所有研究的数据集中被发现，被用于无监督聚类（图1d和补充图2A，分别用于METABRIC和TCGA队列的聚类）。在每个队列中，所得到的三个聚类与淋巴和骨髓Nanodissect评分显著相关（图1e；补充图2B）。淋巴和髓细胞浸润从簇A（蓝色；低浸润；冷肿瘤）逐渐增加到簇B（浅蓝色；中等浸润）和簇C（粉红色；高浸润；热肿瘤）。

对于额外的一层验证，使用METABRIC队列中免疫浸润的病理评估，这与Nanodissect评分（图1f和补充图2C）和免疫簇显著相关。使用PanCancer免疫剖析阵列的基因进行无监督分层聚类，可以根据免疫浸润的渐进水平对乳腺癌肿瘤进行分组。

02 - 免疫簇与预后相关

对于两个最大的队列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，发现簇B(具有中等水平的免疫浸润)与更差的预后相关(补充图3A，B)。当分别对ER阴性（补充图3C，D）和ER阳性（补充图3E，F）的病例进行分层时，也观察到簇B病例的这种更差的结果。为了完善观察结果，根据簇B（浅蓝色）与簇A和簇C（紫色）绘制了患者生存期图，并证实簇B患者的预后明显且显著恶化（图2）。用相关生存数据在另外四个队列中进一步验证了这一结果。结论是免疫簇与ER阴性和ER阳性乳腺癌的预后相关。

03 - 用二项式逻辑回归预测免疫簇

基于免疫聚类的临床相关性，旨在开发一种通用的方法，能够准确而敏感地预测患者的预后较差的分类，而不必依赖于无监督聚类。作者使用二项式逻辑回归，通过lasso进行惩罚，得到一组基因，这些基因可以敏感和特异地预测一个样本是否属于簇B，通过接收者操作特征曲线和曲线下面积（AUC）分析评估（图3a）。96.3%的样本被模型预测为簇A和簇C，而68.8%的样本分到了簇B（图3b）。

通过比较生存期对数秩检验p值，发现lasso分类普遍改善了免疫簇与生存期之间的显著关联。lasso模型在另外5个队列中得到了验证。图3c-e为STAM(n = 856)、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)，补充图5A、B为CAL(n = 118)和PNC(n= 92)。

由于二项式逻辑回归只预测了两个簇（簇B与簇A和簇C），进行了另一轮二项式逻辑回归，以高准确度区分簇A和簇C（补充图5C，D）。

04 - 免疫簇，一个独立的预后因素

作者进一步研究了免疫簇与乳腺癌中著名的临床病理特征（大小、年龄、等级、阶段、淋巴结受累和分子亚型（PAM50））的关系。簇A（免疫浸润度低）富含ER阳性和Luminal病例，而簇C（免疫浸润度高）中ER阴性和Basal样病例比例较高，ER阴性和ER阳性样本以及PAM50亚型在预后不良的簇B中同样占有一定比例（图4a，b）。

使用多变量Cox回归分析测试了免疫簇的预后影响，同时考虑了其他视黄醇的抗衰老油预后因素。发现免疫簇是模型生存的重要因素，如每个队列Cox模型中与免疫群相关的显著p值所示。为了进一步检验免疫簇作为重要的预后生物标志物的优势，采用了逐步回溯选择的方法。对于所有队列，免疫簇被保留在最佳拟合的最小模型中，在11个队列中的9个队列中，免疫簇是一个显著的预后变量。

05 - 具有复发风险（ROR）评分的新RNA-seq数据集的验证

EMIT0，这是OSLO2队列研究的一个子集，OSLO2-EMIT0由食品和药物管理局批准的Prosigna复发风险（ROR）分数评估，ROR评分在标准的临床病理特征之上增加了重要的预后信息。发现簇B组成的样本与簇A和C相比具有中间的ROR评分（图4c），表明与簇B相关的不良预后不可能由ROR评分中包含的信息来解释。当分别评估ER阴性（补充图7A）和ER阳性（补充图7B）病例时有同样结果。对于所有队列通过已有方法计算ROR评分，该方法与PAM50亚型有关，并证实簇B由中间ROR评分组成（图4d和补充图7C，D）。

多变量回归分析证实，免疫簇为ROR评分带来了额外的预后价值，这体现在用ROR评分和免疫簇建立生存模型时，免疫簇的p值显著。通过计算净重分类改善（NRI）和综合判别改善（IDI）指数，强调了免疫簇与ROR评分一起使用时，根据生存率对患者进行分类的额外价值，正如所有队列中NRI和IDI系数为正值所示。NRI和IDI的置信区间（CI）构建的Bootstrapping显示，对于几个队列，免疫簇与ROR评分相加时，显著改善了患者根据预后的分类。

06 - 免疫簇和对新辅助化疗的反应

进一步评估了免疫簇与新辅助化疗反应之间的关系，使用了来自8项研究（1377个样本）的基因表达数据，并使用lasso将每个样本分配给其所属的免疫簇。如图4e，发现簇C应答者百分比最高，其次是簇A，簇B应答者百分比最低。还计算了每个组中应答者的百分比：簇C平均有42%的应答者和58%的残余疾病患者，而簇B有18%/82%的应答者和13%/87%的残余疾病患者。由于pCR率作为ER状态的函数不同，还独立计算了ER阳性和ER阴性病例的应答者比例，发现无论ER状态如何，簇B的应答者比例最低（分别为补充图8A、B）。

对于每个对新辅助化疗有反应的队列，评估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布。当考虑整个队列时，发现应答者在各免疫群组的分布有显著不同，簇B的应答者较少，簇C组的应答者居多；当按ER状态拆分时，虽然并非总是显著，但也观察到同样的趋势。这些结果表明，簇C中的患者有更高的概率成为应答者。研究结果还突出了簇B的低响应率，表明这类患者可能是新的新辅助治疗方案测试的候选人。

07 - 免疫簇的计算机剖析

为了评估集群中的逐渐免疫浸润是否可以解释与预后的关联，在Cox多变量回归分析中测试了免疫集群或总免疫浸润评分中哪一个对生存更有预测性。作者假设特定的免疫细胞类型混合物，而不是肿瘤微环境中的免疫细胞总数，可能是簇B预后差的原因。

使用CIBERSORT算法估计22种不同的免疫细胞类型的比例，对这种细胞类型特异性中位数浸润分数进行无监督聚类（图5a）。簇C病例中，富集了巨噬细胞M1、记忆激活T细胞和滤泡T辅助细胞（图5a），METABRIC和TCGA队列中CIBERSORT评分的分布也说明了这一点（图5b）。簇A如预期的那样，免疫细胞的水平非常低。在反应和预后较差的簇B中，发现巨噬细胞M2、静止肥大细胞和静止记忆T细胞的水平较高（图5a，图5b）。

使用广义线性模型，指定了区分簇B与簇A-C的免疫细胞类型（图5c）。还测试了哪些免疫细胞类型解释了簇A与簇B之间的差异和簇B与簇C之间的差异。

08 - 免疫簇的表型分析

通过差异基因表达分析确定了簇B中显著过度表达的基因，与簇A和簇C相比，簇B中有909个基因分别上调。这些基因与干细胞生物学和EMT相关，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（图6a）。

为了进一步描述免疫簇与癌细胞表型之间的关系，使用了与EMT、干细胞、缺氧和增殖相关的基因集。使用GSVA方法计算了每个集群和队列的平均基因集富集分数，该分数反映了免疫集群中每个路径/基因集的活动。平均基因集分数的无监督聚类将免疫簇A和C分开，而簇B被分为两个亚组（图6b）。这些结果表明免疫簇与干细胞/EMT相关基因特征之间存在关联。

通过GSVA富集分数的无监督聚类，确定了乳腺癌中两个相互排斥的基因特征：（i）一个与增殖和胚胎干细胞样表型相关，（ii）另一个与EMT和乳腺干细胞表型相关。增殖表型在簇C中占主导地位（补充图11A），当计算每个代谢样品的基因集得分时也观察到了同样的情况（补充图11B）。在簇B中，EMT或增殖相关特征的平均基因集得分较高（补充图11C）。在代谢物组的样品水平上，我山东储存造血干细胞的费用是多少们观察到一个或另一个状态被激活的样品的类似模式（补充图11D）。簇A显示EMT和增殖状态得分较低（补充图11E，F）。

为了正式确定哪些基因集分数解释簇B，使用广义线性模型测试每个基因集的贡献程度。EMT标志对簇B有积极贡献，而增殖和细胞运动性与簇A和C相关（图6c）。还测试了当单独与簇A或簇C比较时，哪种基因集得分可以解释簇B。

09 - 肿瘤表型与免疫浸润的相关性

由于免疫簇与（i）免疫细胞类型和（ii）基因集特征相关，评估了免疫浸润（CIBERSORT）和癌细胞特征（基因集分数）之间的关系。图6d显示增殖和EMT分数与不同类型的免疫细胞显著相关。高EMT分数与巨噬细胞M2、静息肥大细胞和静息记忆T细胞相关，而高增殖与更活跃的适应性肿瘤微环境相关。这些数据表明癌细胞表型和肿瘤微环境的组成之间存在连续性。

簇B以致瘤免疫浸润为主，EMT信号高，但约35%的簇B也表现为增殖表型。为了探索簇B中的这种异质性，以无监督的方式根据基因特征分数将样本分组为B1以EMT表型为主，B2以增殖为主（图6e）。

在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的预后较差（图6f，g）。为了进一步评估基因集评分的异质性是否伴随着免疫环境的异质性，作者寻求B1和B2亚群之间特异性免疫细胞类型的差异。补充图14中的无监督聚类显示，两个子聚类B1和B2都具有促肿瘤/静息免疫微环境。总而言之，簇B中两种相互排斥的状态可能与预后有关；然而，簇B的一个统一因素是存在促肿瘤/静息免疫微环境。

四、结论

在本研究中，发现了与临床相关的免疫簇与渐进性免疫浸润。在15个乳腺癌队列中，跨越6101个乳腺癌样本，肿瘤免疫浸润中等水平的患者群预后较差，与已知的预后分子和临床病理学特征无关。通过对群组免疫成分的表征，发现亲肿瘤免疫浸润与不良预后组相关。进一步的表型分析显示乳腺癌中存在两种相互排斥的侵袭性肿瘤表型，一种与EMT有关，另一种与增殖有关。这两种表型都是在不活跃/促肿瘤免疫微环境上发现的不良预后群。

单细胞文献5-通过单细胞测序对处于恢复期的COVID-19患者进行免疫细胞分析

影响因子： 6.255PMID： 32377375 期刊年卷：Cell Discov 2020;6 生物二区 细胞生物学 Q2 60/190

DOI： 10.1038/s41421-020-0168-9

使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。

用于了解SARS-COV-2清除后的免疫细胞组成（来自PBMC）

回顾性了解免疫细胞反应并告知可能的疫苗设计/药物靶标

用于识别康复患者的免疫特征

作者将患者区分为早期康复阶段（n = 5，ERS，自从对COVID19呈阴性以来7天）和晚期康复阶段（n = 5，LRS， 14天），并将这些患者与健康对照组进行比较（n = 5）

PBMC的单细胞RNA测序

scBCR-seq和scTCR-seq评估扩增的B细胞和T细胞克隆的克隆性

计算方法没有得到很好的描述，因此某些数字并未直接突出显示得出的结论

使用的某些工具不是标准的工作流程工具，因此需要在方法中进行进一步说明

优点：

缺点：

由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近影响了1,200,000多人，造成60,000多人丧生。关键的免疫细胞亚群发生变化，其在COVID-19过程中的状态仍不清楚。作者试图通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化。发现在COVID-19的早期恢复期（ERS）中，患者的T细胞显著减少，而单核细胞增加。具有较高炎症基因表达的经典CD14 ++单核细胞比例增加，并且ERS中CD14 ++ IL1β +单核细胞的丰度更高。CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显著减少，并在ERS中表达高水平的炎症基因。在B细胞中，浆细胞显著增加，而幼稚B细胞减少。确定了几个新的B细胞受体（BCR）的变化，例如IGHV3-23和IGHV3-7，并确认了以前用于病毒疫苗开发的同种型（IGHV3-15，IGHV3-30和IGKV3-11）。最强的配对频率IGHV3-23-IGHJ4表示与SARS-CoV-2特异性相关的单克隆状态，尚未有报道。此外，综合分析预测，IL-1β和M-CSF可能是炎性风暴的新型候选靶基因，而TNFSF13，IL-18，IL-2和IL-4可能对COVID-19患者的康复有益。作者的研究提供了ERS中炎症性免疫信号的第一个证据，提示出院后COVID-19患者仍然易受伤害。新的BCR信号转导的鉴定可能导致开发用于治疗COVID-19的疫苗和抗体。

为了绘制COVID-19患者的免疫微环境图，作者鉴定了血液中的镜像变化，并查明了与疾病严重程度和恢复相关的细胞特异性变化。然后，作者从 早期恢复阶段（ERS）或晚期恢复阶段（LRS）（70,858 PBMC）的总共10例COVID-19患者中整合了scRNA-seq，单细胞配对BCR和单细胞配对TCR分析。作者还从五个健康供体作为对照收集了scRNA-seq数据（57,238个细胞）（图 1a ** 和补充图 S1a–c ）。**该数据集通过了严格的高质量过滤。使用10x Genomics将scRNA-seq样品的单细胞悬液转化为条形码的scRNA-seq库。Cell Ranger软件（版本3.1.0）用于测序数据的初始处理。

图1：COVID-19患者单免疫细胞谱分析的研究设计和分析

作者使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE），根据典型谱系标记物和在每个簇中上调的其他基因的表达，分析了三种免疫细胞谱系，髓样，NK，T和B细胞的分布（图 1b，c ）。对于标记基因，位于t-SNE中的每个细胞中的表达值如图 1d 所示。接下来，作者分别将每个谱系的细胞聚类，并鉴定出总共20个免疫细胞簇。

从COVID-19感染中恢复过来的患者的免疫细胞区包括所有主要的免疫谱系。作者分析了通过质量控制的128,096个scRNA-seq概况，包括来自五个HC，五个ERS和五个LRS患者的36,442个髓样细胞，64,247个NK和T细胞以及10,177个B细胞。补充图 S2a中 显示了每个主题的粗略聚类分析景观，图 2a中 显示了每个组的合并图像。作者发现，与HCs相比，包括ERS和LRS在内的COVID-19患者的髓样细胞比例更高，但NK和T细胞比例更低（图 2b，c ）。有趣的是，与ERS患者相比，LRS患者的B细胞，NK和T细胞更多，但髓样细胞却更少（图 2b，c ）。因此，这些发现表明COVID-19患者外周血中淋巴细胞计数降低，而髓样细胞计数升高。

为了进一步了解COVID-19恢复早期和晚期患者中单核细胞的变化，作者进行了基因表达分析，并使用统一流形近似和投影（UMAP）将髓样细胞亚群化为六个转录不同的亚群。

经典CD14 ++单核细胞（M1），

非经典CD16 ++（FCGR3A）CD14- / +单核细胞（M2），

中间CD14 ++CD16 +单核细胞（M3），

CD1C + cDC2（M4），

CLEC9A + cDC1（M5 ）和

pDC（CLEC4C +CD123 +）（M6）

存在于六个不同的簇中（图 3a，b ）。作者发现在HCs和COVID-19患者之间，单核细胞亚群的区室显著不同（图 3c ）。在髓样细胞中，ERS患者中经典CD14 ++单核细胞（M1）的比例高于HCs，而LRS患者中则几乎是正常的（图 3c ）。

图3：恢复期COVID-19患者血液中的髓样细胞亚群及其状态

作者发现，COVID-19患者的CD14 ++ IL1β +单核细胞和IFN激活的单核细胞比HCs富集（图 3d–f ）。与CD14 ++炎性单核细胞（M1）相关的基因具有高表达水平的炎性基因，例如 IL1β，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 。趋化因子 CCL4，CXCR4 ; 以及干扰素刺激的基因 IFRD1，IRF1 和 IFI6 。相比之下，与HCs中的CD14 ++单核细胞（M1）相关的抗炎基因在COVID-19患者中被下调（图 3d，e ）。值得注意的是，UMAP中的IL1β表达值同时具有对比，表明ERS组中IL1β上调，而LRS患者中IL1β下降（图 3f ）。与HCs相比，ERS组的DC集群中也证实了这一点（补充图 S3a，b ）。接下来，作者获取了COVID-19患者与HCs中每个髓样细胞scRNA-seq亚型的平均炎症基因（补充图 S3c ）。这些结果表明，细胞因子的激活驱动单核细胞群的扩展（尤其是CD14 ++感染COVID-19的患者中的炎性单核细胞）。为了探索M1簇中转录变化的生物学意义，作者用DEG进行了GO分析（图 3g ）。作者观察到与细胞因子信号传导和炎症激活相关的途径的富集，这是由 IFITM3 和 IFI6 和 IL1β，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 的上调驱动的（图 3g ）。

T细胞和NK细胞在呼吸道感染中发挥病毒清除关键作用 15 ， 16 。作者的聚类分析基于规范标记（图 4b 和补充图 S4a ）将T和NK淋巴细胞分为10个子集（图 4a ）。

NK细胞高表达NCAM1，KLRF1，KLRC1和KLRD1 ;

（1）NK细胞细分为CD56 + CD16 - NK细胞（NK1），它们表达高水平的 CD56 和低水平的 CD16 ；

（2）C56 - CD16 + NK细胞（NK2），它们表达高水平的 CD16 和低水平的 CD56 。

CD4 + T细胞表达CD3E和CD4 ; 然后将这些细胞细分为四个簇：

（1）幼稚的CD4 + T细胞（T1），它们表达高水平的 CCR7，LEF1 和 TCF7 ；

（2）中央记忆CD4 + T细胞（T2，CD4 Tcm），表达高水平的 CCR7 ，但与单纯CD4 + T细胞相比， AQP3 和 CD69 更高；

（3）效应器记忆CD4 + T细胞（T3，CD4 Tem），表达高水平的 CCR6，CXCR6，CCL5 和 PRDM1 ;

（4）调节性T细胞（T4，Treg），表达 FOXP3 。

CD8 + T细胞表达CD8A和CD8B，并细分为三个簇：

（1）幼稚CD8 + T细胞（T5），其表达高水平的 CCR7，LEF1 和 TCF7 ，与幼稚CD4 + T细胞相似；

（2）效应记忆CD8 + T细胞（T6，CD8 Tm），表达高水平的 GZMK ；

和细胞毒性CD8 +淋巴细胞（CD8 +CTL）（T7），它们表达高水平的 GZMB，GNLY 和 PRF1 。

（3）增殖性T细胞（T8，T prol）是TYMS + MKI67 +细胞。

图4：恢复的COVID-19患者血液中T和NK细胞反应的特征。

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在HCs和COVID-19患者之间，T细胞和NK细胞亚群的组成存在显著差异（图 4c ）。在COVID-19患者中，CD8 + T细胞的绝对数量，特别是效应记忆CD8 + T细胞亚组和NK细胞的绝对数量减少，而ERS中NK细胞的相对比例高于HCs。CD4 + T细胞的比例是稳定的，但HCs和COVID-19患者之间CD4 + T细胞亚群的组成存在显著差异。在CD4 + T细胞中，中央记忆CD4 + T细胞的比例明显更高，而幼稚CD4 + T细胞，Tregs和效应记忆CD4的比例+  T细胞低于HCs，尤其是ERS组。值得注意的是，与CD4 + T细胞相关的基因具有较高的炎症相关基因表达水平，并且在COVID-19患者中明显上调（图 4d ）。CD4 + T细胞在COVID-19的ERS患者中具有高表达水平的炎症基因，包括 FOS，JUN，KLF6 和 S100A8 （图 4e ）。相反，COVID-19患者的CD4 + T细胞相关的抗炎基因相对于HCs被下调（图 4d，e ）。这表明CD4 +T细胞是病毒感染的主要参与者。CD4 + T细胞中DEG的比较揭示了参与细胞因子途径和炎症激活的基因的丰富，包括 IFITM3 和 IFI6 以及 IL1B，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 （图 4f ）。需要进一步的研究阐明与COVID-19发病机制有关的IFN途径。

TCR-seq分析显示，ERS组的T细胞扩增明显低于HC组（图 4g ）。此外，幼稚或中枢记忆T细胞几乎没有克隆扩增，而效应记忆T细胞，末端效应CD8 + T细胞（CTL）和增殖T细胞则显示出更高的扩增水平（图 4h ）。另外，ERS组中扩增最高（最大）的克隆是TRAV8-6-TRAJ45：TRAV7-8-TRBJ2-1（补充图 S5d ）。COVID-19患者中CD8 + T细胞比例的降低可能暗示了CD8 + T细胞在病毒清除中的作用（图 4c ）。而且，CD8 +与HCs中的克隆相比，具有扩展克隆的CTL还表现出过度活化的炎症和抗病毒活性（图 4i 和补充图 S4b ）。总之，这些发现表明COVID-19患者外周血中CD8 + T细胞的克隆扩增有助于控制该病毒。作者还通过Seurat FindAllMarkers 分析进行了DEG分析，并在T prol细胞中发现了相似的结果（补充图 S4c ）。接下来，作者将COVID-19患者中每个NK和T细胞亚群scRNA-seq子集的炎症基因与正常RNA-seq数据的 平均值进行比较 （补充图 S4d ）。

通过使用扩散图预测B细胞的基因表达数据，作者使用

scRNA-seq鉴定了四个B细胞簇：

表达 CD19，CD20（MS4A1），IGHD，IGHM，IL4R和 TCL1A的 幼稚B细胞（B1）；**

表达 CD27，CD38和 IGHG的 记忆B细胞（B2）; **

仅表达 CD19和 CD20（MS4A1）的 未成熟B细胞（B3 ） ；**

以及表达高水平 XBP1和 MZB1的 浆细胞（B4）（图 5a，b 和补充图 S5a ）**。

图5：在COVID-19患者中单细胞B细胞的表征。

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与HCs相比，COVID-19患者的浆细胞百分比显著增加，而COVID-19患者的幼稚B细胞百分比显著降低（图 5c ）。记忆B细胞和浆细胞（MPB）可能在病毒感染的控制和过继免疫的发展中起重要作用，因为它们协同工作并诱导特异性抗体。此外，与 HCs相比 ，包括 S100A8，IGLL5，SSR3，IGHA1，XBP1 和 MZB1 在内的B细胞活化相关基因主要在ERS组的MPB中表达（图 5d ）。作者还在浆细胞，抗体分泌细胞（ASC）中发现了类似的结果（补充图 S5b，c ），提示ASC在病毒控制中起关键作用。接下来，作者将COVID-19患者每个B细胞亚群的炎症基因平均值与正常RNA-seq数据进行比较（图 5e ）。ERS和HCs之间的基因差异表明COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌增强。GO分析表明， MPHA中IGHA1，XBP1，MZB1，JUN，POLR2L 和 ZFP36 的表达过高，这表明COVID-19患者的B细胞增殖和病毒转录增强（图 5f ）。单细胞BCR-seq分析表明，与HC中相比，COVID-19患者中IgA同种型的表达过高（图 5g） ）。这与血清IgA水平升高相对应，这在其他冠状病毒感染中也很明显。此外，在ERS患者中，（IgA + IgG + IgE）与（IgD + IgM）的比例显著增加，并且随着恢复时间而呈下降趋势（图 5h ）。

使用sc-BCR-seq评估患者血液中克隆扩增的状态，作者发现IL4R +幼稚B细胞显示出很少的克隆扩增，而CD27 + CD38 +记忆B细胞显示出在各种B细胞亚群中最高的扩增水平（图 6a ）。在个体水平上，作者发现与HCs相比，COVID-19患者的克隆明显扩增，这支持了B细胞在SARS-CoV-2感染下经历了独特的VDJ克隆重排的假设。作者还发现，与LRS患者相比，ERS中始终保持较高的B细胞克隆性（图 6b）。 ）。此外，对每个受试者的最大扩增（最大）克隆的定量显示，ERS组中最大克隆的比率高于HCs中的最大克隆的比率（图 6c ）。为了了解扩增的克隆B细胞的功能状态，作者在克隆的记忆B细胞和其他B细胞之间进行了DEG分析。作者的结果表明B细胞基因的表达增加，包括 CD27，SSR4，IGHG1，MZB1 和 XBP1 ，这进一步支持了扩增的克隆B细胞的优异效应子功能（图 6d ）。而且，随着时间的流逝，扩增的B细胞的差异基因会明显消退，而在LRS患者中会降低（图 6d ）。

图6：在COVID-19患者中观察到BCR克隆扩增，VDJ基因使用偏倚。

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为了研究COVID-19患者中BCR的独特变化和偏好基因，作者比较了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情况。作者确定了IGHV3家族的过度表达，COVID-19患者相比尤其是在IGHV3-7，IGHV3-15，IGHV3-21，IGHV3-23和IGHV3-30 （图 6E ）。优选的IGKV是IGKV1-17，IGKV2-28和IGKV3-15，而优选的IGLV是IGLV1-44，IGLV2-8和IGLV3-27（图 6e ）。此外，ERS患者的前两个配对频率是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6（图 6f） ）。这些细胞显示出IGH亚基与分别由IGLV1-44-IGLJ3和IGKV1-17-IGKJ1编码的IGK / L亚基配对，这表明与SARS-CoV-2特异性相关的扩展状态。单独地，ERS-4和ERS-5具有最大的克隆，分别参考IGHV3-23-IGHJ4（补充图 S5e ）和IGHV3-7-IGHJ6（补充图 S5f ）。

总之，以IgA和IgM同种型为主的COVID-19克隆性的增加，以及IGHV基因的偏斜使用，提示SARS-CoV-2对发病机理的贡献。值得注意的是，COVID-19患者中主要IGV基因（尤其是IGHV3-23和IGHV3-7）的偏好为合理设计SARS-CoV-2疫苗提供了框架。

用于预测可能有助于ERS和LRS中T细胞，B细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）不同功能状态的细胞间相互作用（图 7a，b ）。在ERS COVID-19患者中，作者发现了与单核细胞激活，增殖和炎症信号有关的适应性信号（图 7a，b ）。

T细胞表达的基因编码TNFSF8，LTA，IFNG，IL17A，CCR5和LTB的配体与TNFRSF8，TNFRSF1A / TNFRSF14，IFNGR1，IL-17RA，CCR1和LTBR的配体相关，这些基因在单核细胞上表达，可能有助于促炎状态。其他T细胞-单核细胞相互作用涉及CSF2和CSF1的表达。

T细胞可能通过CSF2和CSF1的表达激活单核细胞，而CSF2和CSF1与CSFR（CSFR2 / 1）结合并促成炎性风暴。CD14 +单核细胞簇仅表达IL1β，据预测它将与T细胞表达的IL1RAP结合。T细胞与单核细胞的相互作用可能会增强免疫应答，并且仅针对COVID-19患者（图 7a，b ）。

此外，作者发现单核细胞高表达脊髓灰质炎病毒受体，在脊髓灰质炎病毒复制和诱导NF-κB信号传导的第一步中，它作为脊髓灰质炎病毒的细胞受体。从B细胞单核细胞和B细胞T细胞的相互作用中，作者发现B细胞可以分泌大量IL-6，LTA和LTB，并与在单核细胞中表达的IL-6R，LTAR和LTBR结合，大量的IL-6应用于T细胞，以促进IFN-γ，IL-1β和其他炎症细胞因子和趋化因子的分泌。因此，在ERS COVID-19患者的发病高峰中形成了高表达IL-6及其后代的炎性单核细胞的级联特征（图 7c ）。这些活化的免疫细胞可能大量进入肺和其他器官的循环，并发挥免疫破坏作用。

在LRS COVID-19患者中，预计DC配体会与参与细胞增殖和抗体产生的B和T细胞受体相互作用。作者发现LRS患者的外周血含有多种抗体。作者发现，在作者对DC-B细胞相互作用的分析中，IL18-IL18RAP，TNFSF13-TNFRSF13B，TNFSF13-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF13B和TNFSF13B-TNFRSF13C高度表达（图 7d ）。因此，作者推测DC产生IL-18，TNFSF13和TNFSF13B来促进B细胞的增殖，然后在ERS的血液中分泌许多抗体。

从DC-T和T细胞-B细胞的相互作用中，作者发现DC不仅产生IL-18，而且产生IL-7以促进T细胞的增殖。此外，T细胞产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生（图 7d ）。因此，细胞间的相互作用有助于作者理解为什么COVID-19患者表现出高单核细胞率和低淋巴细胞率，以及为何康复患者外周血中淋巴细胞的比例逐渐增加。

图7：在COVID-19患者中免疫细胞之间的细胞间通讯。

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使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。

10X单细胞空间研究不同肠道区域的免疫细胞图谱

区域肠道免疫监测仍然没有明确的定论。在这项研究中， 整合了单细胞 RNA 测序和空间转录组学，创建了一个胎儿和成人肠道区域图谱，由 59 个细胞亚群组成，其中确定了 8 个新亚群和 ILC 过渡态 。结果表明， 微环境决定了原位细胞分化并塑造了区域分子特征，使不同的肠段具有不同的功能 。对mucins、免疫球蛋白和抗菌肽 (AMP) 的区域表达及其在发育和炎症性肠病中的变化进行了表征。值得注意的是， α-defensins在小肠 LGR5 + 干细胞中表达最多，而不是在 Paneth 细胞中表达，并随着细胞成熟而下调。常见的上游转录因子控制着 AMPs 的表达，阐明了上皮分化过程中 AMPs 的并发变化和空间共表达模式。分析证明了risk genes的细胞焦点与疾病位置易感性的对应关系， identified distinct cell-cell crosstalk and spatial heterogeneity of immune cell homing in different gut segments 。总体而言， 单细胞分辨率转录组的跨时空方法表明，人类肠道的区域环境决定了免疫监视的细胞和分子线索，决定了肠道稳态和疾病 。

肠道免疫监测对于协调身体与环境之间的营养和免疫至关重要，因为它介导了微生物耐受性和病原体防御 。 免疫监视障碍与具有独特区域易感性的疾病有关，例如炎症性肠病 (IBD) 和胃肠道肿瘤 。

最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究为具有区域易感性的疾病期间粘液屏障和免疫细胞的功能障碍提供了新的见解。 然而， 肠道微生物免疫监视的区域模式以及支持监视的细胞、分子和细胞间机制仍不清楚 。 此外，需要揭示胎儿发育和疾病期间免疫监视的变化。

粘液层、上皮细胞和免疫细胞构成了人体肠道的分级免疫监视 。 在本研究中， 旨在整合 scRNA-seq 和空间转录组 (ST) 以创建胎儿、健康成人和 IBD 患者的综合肠细胞图谱，以确定上皮细胞分化和功能形成的分子机制 。 我们的数据通过描绘免疫监视的 区域异质性 及其在胎儿发育和 IBD 中的变化，揭示了区域环境在肠道疾病过程中的贡献。

总共收集了代表十二指肠、空肠和回肠的 14 个活检样本，并将其分离到上皮或固有层中，并基于 10x Chromium 进行了单细胞转录组测序，从 53,749 个细胞中生成了高质量的转录组。 新生成的profiles与来自健康回肠、结肠和直肠 10,19 的 54 个人类样本（37,821 个细胞）的已发布数据一致，形成了一个涵盖上皮、免疫和 stromal compartments的综合细胞图谱 。

根据compartment-specific，无监督聚类初步将细胞分为六个x compartments，即上皮细胞、T/先天淋巴细胞 (ILC)、B 细胞、基质细胞、单核吞噬细胞 (MNP) 和肥大细胞区室。 基于迭代聚类，确定了59个具有独特基因表达和片段分布的子集，其中8个是新定义的 。

M02-LILRB5 + 巨噬细胞 (LILRB5 + CCL3L3 + MRC1 + CD163 + ) 在小肠 (SI)，以特定的趋化因子和受体（CCL3L3、CCL4L2、CCR1、CX3CR1 和 C5AR1）为特征，并分散在固有层中，如空间转录组分析所示。 肠道 LILRB5 + 巨噬细胞能够通过 CX3CR1-CCL3L3/CCL4L2 轴进行utative self-recruitment，可能分别通过 CX3CR1 和 CD163 感知细菌代谢物并限制炎症。 M03-CXCL9 + 巨噬细胞 (CXCL9 + CXCL10 + ) 位于回肠末端和结肠，可能通过 CXCL9/CXCL10-CXCR3 与 cDC1、Th1 样 Trm 和 DP + Th1 样细胞相互作用而与肠道炎症相关。 与 M02 和 M03 相比，M04-CCL18 + (CCL18 + ) 和 M05-MMP9 + (MMP9 + MMP12 + PLA2G7 + ) 巨噬细胞定位于肠道相关淋巴组织 (GALT) 。M05 的传递和分化可能受基质金属蛋白酶 9 和 12的控制 。

B05-FCRL4 + 和 B06-CAMP + 记忆 B 细胞主要位于回肠的 GALT。 B05 中高度表达的趋化因子受体（CCR1、CCR2、CCR6 和 FCGR2A）可能会在炎症期间增强它们的 homing，而由 CAMP 编码的 AMP LL-37 可能会导致 B06 表现出抗菌功能。

正如 RGS5、SOD3 和 GPX3 的上调所表明的那样， 一个罕见但独特的亚群 S06-RGS5 + 内皮细胞呈现出缺氧诱导的内皮细胞凋亡的功能状态 。 SI 填充的 S05-RSPO3 + OGN + 成纤维细胞表达与 S07-RSPO3 + OGN - 成纤维细胞相似的肠道稳态支持基因，其先前已在结肠中鉴定。 然而，S05-RSPO3 + 成纤维细胞上调中性粒细胞和 T 细胞homing趋化因子 CXCL2、3、6，同时下调浆细胞募集趋化因子 CCL7。 值得注意的是，S05 比结肠 S07 表达更高的 C3 和 C7。

NK、ILC1、ILC2 和 ILC3 的谱系特异性基因富集在两个独立的细胞cluster中，即 NK-ILC1 和 ILC2-3 。 ILC2-3 子集共表达 ILC2 相关基因 AREG 和 GFI1，以及 ILC3 标记物 RORC 和 IL22。 重新组合 NK-ILC 的尝试失败，以及伪时间分析反映的连续状态， 表明 NK-ILC 区室存在过渡状态，并通过荧光激活细胞分选 (FACS) 进一步证实 。

构建了一个由 543 个激活的调节模块组成的基因调控网络 (GRN) 。 确定了已知细胞类型的conical transcription factor(TF)，例如用于分泌性肠细胞的 ATOH1 和用于 CD4 + 和 DP 型 3 细胞因子 T 细胞的 RORC，以及新确定的细胞类型的 TF，例如用于 FCRL4 + 记忆 B 细胞和 ZNF7 的 POU2F2 LILRB5 + 巨噬细胞。 层次聚类和差异分析发现了决定细胞亚群分化的调节子开关 。 例如，SOX17 和 TAL1 分别控制淋巴管和血管内皮细胞的分化，随后激活 MSC 以促进 RGS5 + 内皮细胞的生成。 与整个转录组相反， regulon activity将肠细胞分为相同但连续的细胞谱系 。

基于41个独特的GRN和命运决策树，肠的解剖位置深深影响了区域上皮亚群的分化，即SI的GATA4、GATA5和PDX1，以及结肠干细胞的TFCP21、HOXB9和HOXB13， transit-amplifying（ TA) 细胞和未成熟的肠细胞 。 然而， 不同上皮亚群 GRN 对微环境的敏感性是可变的 。 吸收性肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4 + 肠细胞在整个肠道中显示出显着的 GRN 异质性，尽管在簇状细胞和肠内分泌细胞 (EEC) GRN 中并非如此。 Bile acid receptors NR1H4 and NR1H3 were highly expressed in small intestinal stem cells, TA cells, and immature enterocytes, and less so in mature goblet cells, enterocytes, and Paneth cells, indicating the involvement of environmental signals in epithelial cell differentiation since bile acids differ regionally 。

Consistently，伪时间分析显示肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4 + 肠细胞的区域异质性高于簇状细胞和 EEC，在细胞分化过程中增加 。 根据近端 SI、回肠和结肠直肠的局部环境，肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4 + 肠细胞显示出明显的功能富集 。富含脂肪的近端 SI 中的肠上皮细胞显示与脂溶性维生素消化和吸收途径相关的基因上调，例如维生素 A。与它们在近端 SI 的消化、吸收和代谢途径中的富集相反，回肠肠上皮细胞富含多种免疫相关过程，与回肠中过多的淋巴结构相一致。值得注意的是，基于各种粘液相关基因（如 SPINK4、CLCA1 和 FCGBP 以及粘液相关基因）的上调，肠细胞在粘液生物合成和分泌中向消化道末端汇聚为杯状细胞。代谢途径。远端肠道中富集的杯状细胞和杯状肠细胞可能构成增强的粘液屏障，适应微生物群形状的环境。

接下来， 研究了受微环境影响的肠上皮功能亚群 。成熟的肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4 + 肠细胞分别重组为 6、4 和 6 个功能亚群， 具有泛肠分布但具有极端的区域异质性 。以杯状细胞为例，富含直肠的SET + 杯状细胞亚群为早熟，其特点是RNA剪接活跃、mRNA代谢活跃、生长因子反应活跃。 SELENBP1 + 杯状细胞主要分布在结肠中，代表更高的损伤或凋亡，这通过细胞对化学应激的反应和活性氧的解毒作用的增强来揭示。 TFF3 + 和 TFF1 + 杯状细胞均在粘液形成和微生物防御中起作用。 TFF3 + 杯状细胞在结肠隐窝底部富集，表达增加水平的粘液相关基因（RNASE1、AGR2、TFF3、CLCA1 和 SPINK1）和微生物防御相关基因（ITLN1 和 WFDC2）。然而，主要位于 SI 隐窝顶部的 TFF1 + 杯状细胞上调了 TFF1、FCGBP、ZG16 和 LYPD8 的表达水平，这些表达水平与粘液层稳定性和微生物防御有关。值得注意的是，伪时间分析表明 TFF1 + 子集源自 TFF3 + subsets。

对 40 种肠道表达 AMP 的分析表明， 大多数 AMP 在不同肠道区域的表达模式不同 ，例如 SI 和 WFDC2 中的 DEFA5/6、REG3A、REG3G、ITLN2、DMBT1、GBP1、LEAP2 和 H2BC6/7/8 、SLPI、LYPD8、CCL28、ADM、DEFB1、PI3、CCL20、CXCL1、CXCL2、H2BC12/21 和大肠 (LI) 中的 RNASE6。 除 H2BC12 外，SI 和 LI 在远端均显示出较高的 AMP。 此外，AMPs 表达显示细胞特异性，即近端 SI EEC 中的 HAMP、回肠 EEC 中的 TAC1 和近端 SI Paneth 细胞中的 NPY。 值得注意的是，区域特异性 AMP 在特定片段的所有上皮细胞中均有表达，但表达水平不同。 总之， 区域和细胞类型特异性 AMP 表达模式似乎塑造了微生物群落 。

胎儿肠道的进一步 scRNA-seq 谱表明， AMP 的区域异质性出现在出生前的不同时间点 ，例如 DEFA5 为 12-13 PCW，LYPD8 为 15-16 PCW，WFDC2 为 12-13 PCW，尽管胎儿 AMP 水平低于成人。

出乎意料的是，DEFA5/6、REG3A/G、ITLN2 和 PRSS2 在小肠，尤其是近端肠中的表达与 LGR5 呈正相关，并在细胞成熟过程中下降，表明干细胞（而不是表达最高水平的 Paneth 细胞） 溶菌酶编码基因 LYZ) 是某些 AMP 的主要来源，例如防御素 。 免疫荧光证实了 DEFA5、PRSS2 和 LGR5 的共表达。 小鼠空肠绒毛的激光捕获显微切割和测序 (LCM-seq) 显示 AMP 在绒毛底部附近富集，这与我们的数据一起表明 AMP 在小肠隐窝 - 绒毛轴的下部富集。 SI 中 AMP 的这种分布模式可能有助于维持肠道干细胞生态位 。 相反，正如空间转录组学 (ST) 所揭示的，除了 WFDC2 和 ITLN1， 大多数结肠直肠 AMP 在隐窝轴的顶部较高 。

此外， ST 分析显示 GALT 中 AMP 的表达有限，其中 CAMP 主要由 CAMP + 记忆 B 细胞表达，而巨噬细胞产生 HAMP、RNASE6 和 LYZ 。 GALT 的关节结构可能解释了独特的 AMP 表达，并有助于杀死被微褶样细胞捕获的病原体。

考虑到上皮分化过程中 AMP 的同时变化，以及空间共表达模式，我们假设存在标准的 AMP 上游调节剂 。 为了获得机制上的见解，我们生成了 SI 和 LI 特异性 AMP 的转录因子-靶基因网络， 证实了 AMP 的常见上游 TF 的存在 。 有趣的是，SI AMP，即 DEFA5、DEFA6、PRSS2、REG3G、LEAP2 和 REG3A，受胆汁酸受体 NR1H4 和 NR1H3 的调节，这与 AMP 在 NR1H4 和 NR1H3 依赖性肠干细胞中的大量表达一致， TA 细胞和未成熟的肠细胞。 一致地，回肠中最高的胆汁酸浓度可能导致远端 SI 中 AMP 的表达升高，突出了微环境在先天免疫中的作用。

在 IBD 患者中已经注意到几种 AMP 的异常表达。 为了描述 IBD 期间的综合 AMP 反应，我们分析了来自 UC 患者的结肠、CD 患者的回肠以及健康对照组的非炎症和炎症活检的 scRNA-seq 数据。 UC患者结肠上皮显示几乎所有AMPs显着上调，包括富含SI的AMPs，如DEFA5/6、REG3A和ITLN2，并且水平随着疾病的进展而升高（健康非炎症 炎症）。 相比之下，CD 患者回肠上皮的 AMP 改变显示出不一致的趋势，表明 AMP 在 UC 和 CD 的发病机制中具有不同的作用。 UC 期间增加的 AMPs 可能是对致病微环境的补偿性反应，而即使在 CD 期间内镜炎症出现之前抑制 AMPs 可能会加剧病情。

值得注意的是，UC 患者结肠上皮中表达杯状细胞标志物（MUC2 和 ITLN1）的一组上皮细胞显示出上调的 SI 特异性 AMP（DEFA5、DEFA6、REG3A 和 ITLN2）。 根据杯状细胞亚群的功能分析，产生AMP的细胞是位于隐窝底部的TFF3 + 杯状细胞（TFF1─LYPD8─）。

ScRNA-seq 数据显示浆细胞主要分布在近端 SI 和结肠，而滤泡 B 细胞分布在回肠，与 Peyer 斑块的富集一致。 IGHA1 和 IGHA2 等 IgA 相关基因在结肠浆细胞中的表达明显高于小肠。 相比之下，IgM 相关基因 IGHM 显示出相反的模式，表明由 IgM/IgA 类别转换介导的区域免疫监视。 与免疫球蛋白合成、加工和分泌相关的基因在 SI 和 LI 之间也存在差异

基于受体-配体对的细胞-细胞相互作用和网络表示分析表明，不同compartments中的细胞 - 细胞串扰代表了compartmentalization and de-compartmentalization的共存 。 上皮细胞、成纤维细胞和髓细胞compartments（即compartmentalization）内显示更强烈的交流强度，而 T/ILC、B、神经胶质和内皮细胞被de-compartmentalization。 在compartment/细胞串扰的强度中观察到显着的区域异质性（回肠 近端 SI 结肠）， 表明 CD 以回肠为主，其特征是透壁炎症、穿透性和纤维化狭窄，与 UC 的黏膜局限性。 SI 中室间串扰的核心由单核细胞、巨噬细胞和基质细胞组成，而 LI 由 MNP 和上皮细胞组成 。

趋化因子-受体对构成了免疫细胞竞争homing的分子基础 。 结果证明，同一谱系表现出免疫细胞募集的区域特异性能力，从而导致免疫细胞的空间分布。 例如，上皮中 CXCL1、2 和 3 的增加，以及它们向远端消化道的成纤维细胞减少，表明中性粒细胞可能在 SI 中固有层成纤维细胞附近富集，但被募集到结肠上皮。

确定了区域特异性趋化因子，例如 SI 上皮中已知的 CCL25 和新发现的 SI T 细胞、NK-ILC1 和 MNP 中的 CCL3L3 和 CCL4L2。 预测了新的相互作用，即 GPR42-CCL4L2 介导的肥大细胞-T 细胞/NK-ILC1 相互作用，CX3CR1 介导的 LILRB5 + 巨噬细胞和 CXCL9 + 巨噬细胞归巢至表达 CX3CL1 的成纤维细胞和内皮细胞，以及 CCR4 介导的 Treg homing至 CCL22 表达 LAMP3 + DC。 此外，除了幼稚T细胞、滤泡B细胞和肥大细胞外， 所有免疫细胞谱系都存在自我招募的正反馈 。

全基因组关联研究 (GWAS) 确定了肠道疾病的风险等位基因。我们确定了所有 59 个细胞亚群中 9 种疾病的 85 个风险基因的表达，以确定疾病的细胞起源，例如 ILC2-ILC3 中的 CD 风险基因 IL23R 和 MMP9 + 中的食物过敏 (FA) 风险基因 MMP12 和 STXBP6分别是巨噬细胞和肥大细胞。基因集富集分析表明在特定谱系中富集了疾病风险基因。例如，CD、UC、内部结核病和乳糜泻风险基因在MNPs中富集，FA基因在肥大细胞、内皮细胞和滤泡B细胞中富集。与免疫细胞紊乱相关的多种疾病表明异常免疫监视在肠道疾病的发生中起着至关重要的作用。我们进一步研究了五种疾病的细胞和区域易感性，其风险基因在免疫区室中富集，与流行病学特征一致。根据区域趋势，CD风险基因SNX20、CARD9、IL27和PRDM1在回肠CXCL9 + 巨噬细胞中富集，IL10在回肠FCN1 + 单核细胞中富集。 TB 风险基因、TAB3、MICB、TAP2 和 C6orf47 富含回肠 S100A8 + 单核细胞。

提出了一个跨肠道空间的综合细胞和空间图谱，由 59 个细胞亚群组成，其中 8 个是新发现的。 具有独特基因表达、片段分布和空间定位特征的新亚群与炎症进展和微生物防御有关。 确定了 ILC 的过渡状态，这意味着潜在的极化及其对肠道疾病的影响 。

该图谱提供了对环境调节的上皮分化和区域分子和功能特征的新见解。 通过GRN分析表明解剖位置对于区域上皮亚群的分化至关重要 。 不同上皮细胞 GRN 对微环境的敏感性似乎是可变的

确定了整个发育和成年期间 AMP 介导的免疫监视的区域和空间异质性，表明 SI 和 LI 之间存在高度可变的 AMP 模式，这可能与塑造 SI 和 LI 的不同微生物群落有关。 确定了 AMP 在不同区域的干细胞生态位维持中的独特作用。 AMPs 集中在 SI 的隐窝底部，但主要位于结肠隐窝的顶部。 SI和LI AMPs空间分布的这种差异可能符合粘液层的独特结构，需要进一步研究 。

分析的数据显示，SI 中的 LGR5 + 干细胞，尤其是近端，表达最高水平的 SI 特异性 AMP，以 DEFA5/6 为代表。这一结果令人惊讶，因为肠上皮衍生的微生物防御机制过去主要归因于Paneth cells。一项小鼠研究可能将我们数据中的这些 LGR5 + 细胞反映为致力于成熟为分化的分泌细胞的前体。常见的上游 TF 控制 SI 和 LI 中的 AMP，阐明了上皮分化过程中 AMP 的同时变化，以及空间共表达模式。值得注意的是，胆汁酸受体 NR1H3/4 参与调节 SI 特异性 AMP 的表达，强调环境信号参与 AMP 介导的肠道免疫监视，并与胎儿发育过程中逐渐建立的区域 AMP 模式一致，因为大约 17 PCW 是胎儿胆汁分泌开始的关键窗口。有趣的是，隐窝底部的杯状亚群导致了 UC 期间防御素的上调，而不是之前认为的Paneth cells metaplasia。

此外，风险基因的细胞焦点与疾病位置易感性的对应关系，以及不同肠道段中不同的细胞间串扰和免疫细胞的空间异质性，为肠道疾病中区域环境决定的免疫监视提供了新的见解 。 总的来说，我们的数据揭示了人类肠道的区域环境决定了免疫监视的分子线索，决定了肠道稳态和疾病，这可能会为人类医学带来借鉴。

生活很好，有你更好

Cell:东亚最大的eQTL数据库：ImmuNexUT

2021年5月发表在 Cell ( IF=38.639 ) 上的Dynamic landscape of immune cell-specific gene regulation in immune-mediated diseases研究，利用免疫介导疾病 (IMD) 患者的样本构建了28种免疫细胞类型的基因调控图谱，显示了细胞类型和免疫条件对基因调控的动态影响。本文进行了大规模的免疫细胞基因表达分析，以及全基因组序列分析，包含来自 337 名被诊断患有 10 类免疫介导疾病的患者和 79 名健康志愿者的共计 28 个不同的免疫细胞亚群，捕获了不同免疫细胞类型和疾病的独特的基因表达谱。表达数量性状基因座 (eQTLs) 分析揭示了在免疫条件以及细胞类型背景下 eQTLs 效应的动态变化，这种细胞类型特异性的、和环境相关的 eQTLs 显示出与免疫疾病相关的遗传变异的显着富集，并且与疾病相关的细胞类型、基因和环境有关。此外，作者开发了网站ImmuNexUT (Immune Cell Gene Expression Atlas from the University of Tokyo) (https:// ) 便于用户访问数据。

数据：

基因表达数据以及eQTLs分析的统计数据存放于National Bioscience Database Center (NBDC) Human Database ()，存储编号为E-GEAD-397、E-GEAD-398、E-GEAD-420。数据也可以在网站https:// 上浏览。

主要发现：

1.免疫细胞和免疫介导的疾病中基因表达多样性

作者从416个志愿者的9852个样本的基因表达数据中进行分析，包括79个健康的志愿者和337个免疫介导相关疾病的患者，纯化了28种不同的免疫细胞类型，包括几乎所有类型的外周免疫细胞。作者发现基因表达差异大都可以用细胞类型差异来解释，个体间的差异和临床诊断部分对基因表达变异的解释程度较轻。作者使用层次聚类分析表明，基因表达模式准确地再现了分离的免疫细胞亚型。每个细胞亚群都有特定表达的基因，包括细胞因子受体或模式识别受体，表明它们对环境信号有不同的反应。当比较基因模块失调的模式时，IMD被分为两组，主要对应于临床不同的自身免疫性疾病(SLE、MCTD、SSc、SjS、IIM和RA)和自身炎症性疾病(BD和AOSD)。此外，除了IMD中常见的异常调节途径外，一些基因在特定疾病中展现出独特的异常表达情况，暗示了未经识别的致病机制。

2.QTLs表达具有免疫细胞类型特异性

作者利用深度全基因组测序数据(WGS)进行eQTLs分析，平均覆盖率达到41x。作者发现了13395个蛋白质编码基因和3839个长非编码rna的eQTLs，错误发现率为5%，平均每种细胞类型的常染色体基因eGenes中位数为7092个。在25%(中位数)的eGenes中确定了2个或更多的条件独立的变量，与最初的变异eVariants相比，这些基因的变异显示出更丰富的细胞类型的增强子区域。此外，作者观察到生物学上相关的细胞亚群之间eQTLs有明显的相似模式，这展现出了与细胞类型关联的特异性。

3.免疫介导的疾病特异的eQTLs表明体内刺激的影响

为了评估纳入患者来源样本对eQTLs鉴定的影响，作者接下来分别对健康志愿者样本或IMD患者样本的每个细胞亚群进行eQTLs分析。结果发现一些eQTLs仅在IMD患者中显著，并且在不同的细胞类型中IMD特异的eQTLs数目存在差异，但是整体趋势倾向于髓系细胞较多。与在健康志愿者和IMD患者中均显著存在的eQTLs相比，IMD特异性的eQTLs在增强子和刺激后诱导的免疫细胞ATAC-seq峰中显著富集。这些观察表明，使用不同患者来源的样本进行eQTLs鉴定有助于在生理条件下识别刺激依赖的eQTLs，这些eQTLs与疾病生物学相关，而仅在健康志愿者样本中难以检测到。

4. ImmuNexUT与之前的eQTLs研究具有良好的一致性

作者为了评估eQTLs的有效性，将结果与两个外部数据集进行了比较：日本105例健康患者的批量免疫细胞eQTLs研究，和目前最大的3万欧洲人的全血顺式eQTLs数据集。比较发现结果具有较好的一致性，但由于部分细胞类型的稀缺和相对独特的eQTLs特征，数据及之间存在一定的差异，互相提供了补充的信息。

5. 结合来自不同种群的eQTLs数据集可以提高精细定位的准确性

为了评估日本eQTLs数据对eQTLs变异的精细定位的实用性，作者将自己的数据与来自GTEx v8的欧洲全血数据进行了精细定位，利用与全血的eQTLs有较大的重叠的经典的单核细胞和中性粒细胞数据进行了分析。与独立分析相比，联合分析显著减少了候选causal 变异的数量，同时保持了实验验证的功能变量的强富集，这表明结合来自不同种群的数据集进行精细制图是有效的。

6.鉴定体内eQTLs效应多样化的生物学途径

作者分析了每种细胞类型的Top变异，通过随机扰动基因标签校正p值，识别到了5.6%的eGenes有37,875个显著的pGene-eQTL互作。与eQTLs存在显著正互作的pGenes在相互作用的基础上形成了不同的聚类，表明具有相似的基因调控机制相关的功能基因集。总体而言，与eQTLs互作较多的基因在IMD中显示出更多的变异。这些结果表明，将患者样本囊括在内的做法会通过提升pGenes的表达变异情况从而提升环境依赖的eQTLs的检测效能。免疫细胞环境依赖的eQTLs，特别是与疾病条件相关的eQTLs，可能在炎症反应或免疫反应的个体差异中发挥作用。

7. ImmuNexUT将IMD基因与细胞类型、基因和环境联系起来

作者利用eQTLs数据集来解释IMD相关的GWAS信号，使用分层LD回归评分来评估eQTLs与GWAS结果的相关性。当通过联合回归分析的eQTLs注释来制约共享元素时，尽管免疫疾病和免疫细胞eQTLs的特异性关联仍然存在，但大多数非免疫性状的关联会减弱。在某些情况下，GWAS顶部信号的eQTLs效应指向疾病易感基因。因此，作者通过邻近性评估了NHGRIEBI GWAS目录中顶级变异的富集情况，结果与非免疫性状GWAS在GTEx eQTLs中的富集形成对比。并且在系统性红斑狼疮患者中进行了免疫细胞亚群的特异性分析，这些亚群特异性和eQTLs可能对免疫细胞编排有很大影响，并可能与复杂的疾病发病机制相关。 生信人 最热点生信话题

生信分析意向表

抗体分为哪几种？他们的功能分别是什么？

按作用对象

按作用对象，可将其分为抗毒素、抗菌抗体、抗病毒抗体和亲细胞抗体（能与细胞结合的免疫球蛋白，如1型变态反应中的lgE反应素抗体，能吸附在靶细胞膜上）。

按理化性质和生物学功能

按理化性质和生物学功能，可将其分为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五类。

IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体。它们在与抗原结合后启动补体的级联反应。它们还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬；

IgG抗体激活补体，中和多种毒素。IgG持续的时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。他们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿得到保护；

IgA抗体进入身体的黏膜表面，包括呼吸、消化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。还可以通过母乳的初乳把这种抗体输送到新生儿的消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为重要的一类抗体；

IgE抗体的尾部与嗜碱细胞、肥大细胞的细胞膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大细胞释放组织胺一类物质促进炎症的发展。这也是引发速发型过敏反应的抗体；

IgD抗体的作用还不太清楚。它们主要出现在成熟的B淋巴细胞表面上，可能与B细胞的分化有关。（IgD于1995年从人骨髓瘤蛋白中发现，分子量为175kD，主要由扁桃体、脾等处浆细胞产生，人血清中IgD浓度为3～40μg/ml,不到血清总Ig的1%，在个体发育中合成较晚。IgD铰链区很长，且对蛋白酶水解敏感，因此IgD半衰期很短，仅2.8天。血清中IgD确切的免疫功能尚不清楚。在B细胞分化到成熟B细胞阶段，除了表达SmIgD，抗原刺激后表现为免疫耐受。成熟B细胞活化后或者活化后或者变成记忆B细胞时，SmIgD逐渐消失。）

按可见反应

按与抗原结合后是否出现可见反应，可将其分为：在介质参与下出现可见结合反应的完全抗体，即通常所说的抗体，以及不出现可见反应，但能阻抑抗原与其相应的完全抗体结合的不完全抗体。

按抗体来源

按抗体的来源，可将其分为天然抗体和免疫抗体。

抗体就是免疫球蛋白，是改变了的球蛋白分子。由特异性抗原刺激产生，抗体的产生是由于抗原侵入人体后引起各种免疫细胞相互作用，使淋巴细胞中的B细胞分化增殖而形成浆细胞，浆细胞可产生分泌抗体。

按抗体发展

单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。

鼠源性单克隆抗体：鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。

嵌合性单克隆抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。

人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术（phagedisplay）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenicmouse）和单个B细胞抗体制备技术等。

由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点，克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点，已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。