外泌体干细胞操作方法（外泌体间充质干细胞）

干细胞怎么打法

静脉注射、腰穿、立体定位导航。

1、静脉注射，就像输液一样的干细胞美容价位。

2、腰穿，就是从一个固定的地方下腔蛛网膜注射进入，这种方法对操作医生的要求比较高。

3、立体定位导航，这个相对于前两种移植方法危险较大，但如果成功，对病人的效果是最明显的。

干细胞是人体最基本的细胞，具有无限分化，多项潜能的特点。又叫万能细胞，什么都能干的细胞。干细胞分为很多种，如果是造血干细胞或骨髓间充质干细胞，最常用的，主要取骨髓，进行分离培养。如果是表皮干细胞，这个只处于研究阶段，只要取1至2mm的皮肤就够了黑绷带和海蓝之谜面霜哪个抗衰老好，如果是其他成体干细胞，如胰腺干细胞，精原干细胞，乳腺干细胞等，也要在特定组织内分离。

什么是外泌体？

什么是外泌体

人到中年，最难以启齿的矛盾便是脸上越来越多的皱纹和内心与日俱增的

“抗老需求”之间的矛盾。为了今天的容颜不被明天改变，什么玻尿酸、水光针甚至是干细胞美容，我干细胞美容南京都勇于“尝鲜”。而作为美容界的后起之秀——“外泌体”，我更是不愿错过。毕竟它虽然是近两年兴起的美容模式，但其发展历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是有口皆碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“江湖大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体，从字面上看，就是细胞向外分泌的物体。科学释义是：细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。

外泌体的作用机理

外泌体最大的功能便是人体的“通信兵”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞货拉拉”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“卸货搬家”。

希吉亚外泌体分离方法

外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，希吉亚外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法等。

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超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。

希吉亚外泌体美容机制

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免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。

促进细胞再生。外泌体可以有效刺激受体细胞，释放细胞活力，促进其再生和新生。因而可以帮助淡化祛除斑点，促使肌肤光亮细腻。

修复受损细胞。外泌体外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成，从而让帮助修复受损的肌肤屏障。而且它可以提高受损部位的修复能力和愈合能力。

抑制炎症产生。外泌体可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而降低了巨噬细胞诱发炎症反应的能力，从而抑制炎症。我们肌肤的很多问题都与肌底炎症有关，而外泌体可以通过抑制炎症来让肌肤从内而外的健康起来。

干细胞疗法围绕使用完整细胞来替代丢失的组织。相反，外泌体是与细胞分离的囊泡。外泌体促进恢复青春活力的方式是利用外泌体中携带的有效成分来帮助其他细胞。

干细胞和外泌体的另一个主要区别是前者仅从身体的特定部位获得，例如：骨髓、血液、脂肪组织。而外泌体，可以从几乎所有类型的细胞中获得。胎盘中也含有大量的外泌体。

通过上述科普，大家对外泌体美容一定有了更全面的认识

干细胞外泌体生发技术——绽发

“绽发”是佰鸿集团旗下子公司创建的干细胞外泌体头皮健康管理品牌，绽发品牌开发了头皮养护、抗衰、生发等系列产品，采用干细胞外泌体提取纯化技术和天然植物功能性小分子提取纯化技术，以恢复头皮正常微环境、补给头皮所需营养、修护问题毛囊为目的，从根部解决头皮出现的一系列问题：头油、头痒、头屑、敏感、脱发断发等。

根据国家卫健委2019年发布的脱发人群调查数据显示，我国的脱发人群已经超过2.5亿，平均每6个人中就有1名脱发患者，其中20岁至40岁的脱发人群在总脱发人数中占比较大。同时据相关研究数据，脱发的年轻化趋势明显：中国的脱发年龄提前了20年！近四分之一的男性会在21岁开始脱发，66%的男性会在35岁经历脱发；而接近1亿的女性脱发群体中，有60%的人在25岁就出现了脱发现象。

脱发的真正原因是什么？

毛囊控制毛发的生长，人类拥有大约5百万毛囊，其中大约80000到150000在头皮部位，正常的毛发生长周期包括 3 个阶段:2～6年的生长期，2～3周的退化期和大约 12 周的休止期。正常头发 90%～95%的毛囊在生长期，1%进入退行期，5% ～10% 为休止期，至休止期时毛发脱落，进入下一个生长周期。

然而脂溢性脱发（AGA）患者的头发生长期明显缩短：由于生长期的长短是毛发长短的决定性因素，因此AGA患者新的头发的最大长度远比原来的头发要短，与此同时，休止期的头发比例大幅上升，进而导致大量纤细的头发产生，久而久之，便产生了明显的脱发。

治疗脱发恢复毛囊的生长周期是关键！

而恢复毛囊的生长周期循环，信号物质是关键！

毛囊的活性受控于缜密严谨的秩序 ，会受到各种不同内在因素影响：细胞因子、荷尔蒙、神经传递素、转录因子等。大量研究发现，多种信号物质调控着毛囊的生长，尤其是VEGF、IGF、HGF、KGF、HIF-1α、ANG等【血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、缺氧诱导因子(HIF-1α)和血管生成素(ANG)等】而信号物质正常的表达和分泌会受到激素变化、应激水平、自然老化等刺激的影响，从而改变毛囊的生长周期。

什么是外泌体？

外泌体是细胞在特定刺激条件下分泌产生的40-100 nm的细胞外盘状囊泡，是细胞间相互沟通与影响的重要工具，外泌体作为细胞的信号分子，可直接进入细胞，影响细胞功能。

2015年，以金岩为首席科学家的科研团队在国际权威生物学杂志《Nature》上发表论文证实了携带年轻生长因子的外泌体可以延缓衰老！该篇论文获得了影响因子（Impact Factor）为18.16的高影响力评级！

绽发首次将外泌体技术运用于头皮健康领域

绽发通过超速离心+超纯过滤技术，获得纯度超高的外泌体，年轻的外泌体进入头皮细胞，激发头皮活力。绽发产品所含有的高纯度外泌体蕴含细胞发挥正常生理功能所需的多种信号物质，这些信号物质是使我们毛囊恢复正常生理功能的关键性因素。通过激活毛囊干细胞，延长毛囊生长期从而抑制其提前进入退行期；同时活化处于休止期的毛囊干细胞，使毛囊进入生长周期。

外泌体的应用优势：

1.外泌体具有磷脂双层膜结构，可直接进入受体细胞；

2.外泌体包含多种细胞因子；

3.外泌体具有高度生物相容性，具备免疫惰性。

4.体积小，能够穿越人体厚实的组织屏障。

绽发外泌体调控能力：

1.毛囊干细胞激活与分化增殖调控

2.毛囊生长微血管修复与微环境调控

3.头皮衰老细胞替代与修复

绽发产品功效：

1.修复：修复受损头皮细胞，重塑头皮抵御屏障；

2.激活：激活毛囊干细胞，促进毛乳头细胞增殖，诱导毛囊快速进入生长期；

3.抑制：抑制5α还原酶活性，抑制脱发因子DHT的生成；

4.改善：改善血液循环，促进营养物质吸收；

5.固发：给头皮供能，维持毛发的健康生长。

绽发产品适用范围

1.脂溢性脱发、产后脱发、斑秃、等各类脱发问题；

2.头油、头屑、头皮炎症、头皮老化、等各类头皮问题。

绽发，您身边的头皮健康管理专家！

科技绽放发丝之美！

再生医学材料的黄金搭档：外泌体与细胞外基质

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外泌体的概念

上世纪80年代，外泌体首次被科学家发现，并且在很长时间内被认为是细胞的代谢产物。由于当时分析和研究的手段受限，外泌体的功能并不明晰。直到21世纪，科学家们才通过各种新技术，分离和提取出外泌体，并发现 外泌体在细胞之间充当重要的沟通介质，进而影响细胞而至组织的生理活动。

细胞可以通过分泌细胞外囊泡与临近细胞或者远端细胞进行通信，而外泌体正是其中一类尺寸小于200纳米的细胞外囊泡。外泌体是在多泡核内体或多泡体中产生的，并在这些囊泡与质膜融合时分泌。外泌体由与细胞类似的磷脂双分子层组成，该双分子层含有跨膜蛋白和胞质蛋白和RNA；外泌体的内部包含一系列蛋白质 （胞质、骨架和生长因子） 和传递特定功能线索的miRNAs。因此，外泌体可以通过其表面的磷脂双分子层上蛋白靶向到受体细胞。外泌体一旦附着在靶细胞上，可通过受体-配体相互作用诱导信号转导，或通过内吞和/或吞噬作用内化，甚至与靶细胞的细胞膜融合，将其内容物传递到靶细胞的胞质中，从而改变受体细胞的生理状态。外泌体具有良好的生物相容性，不易在机体内引发免疫排斥反应。

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外泌体的提取

所有的细胞都可以分泌外泌体，机体的体液内和间质中均含有大量的外泌体。由于生物体内所含有的细胞或者蛋白非常丰富，因此从体内提取外泌体是非常困难的，而且外泌体来源的细胞也无法确定。

现如今有两类广泛使用的用于提纯外泌体的方法：超速离心法和Thermo Fisher等公司生产的提纯试剂盒。

超速离心法，主要是通过将实验室培养干细胞所得到的培养基通过滤膜滤掉尺寸较大的细胞碎片及细胞外囊泡后，通过超速离心机在100,000g的离心力的作用下富集得到外泌体。

提纯试剂盒，主要是通过试剂包被外泌体，使其尺寸和重量增大，从而在10,000g的离心力即可得到外泌体。试剂盒的使用有导致外泌体污染的风险，在科研领域超速离心法更为常见。

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外泌体的生物学特性

由于外泌体在再生医美领域显示出极大前景，这也迎来产业化合作的新浪潮，眼下外泌体似乎已经成为下一个生物医药的黄金赛道。科学家们普遍认为， 外泌体具有其独特的生物学特征，可以反映来源细胞的表型 。

图 5 外泌体促进皮肤修复

不同细胞分泌不同的外泌体，因此外泌体的应用是多种多样的。一方面， 外泌体被认为是多种癌症的疾病诊断生物标志物。 外泌体独特的miRNA谱图和疾病载体作用，使得其频繁出现在卵巢癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌。另一方面， 外泌体也可以作为细胞信号传导的有效媒介而广泛用于医学再生领域。 例如，它们能够将RNA和蛋白质的信息从来源细胞转移到周围环境中的其他细胞。实验证明，来自小鼠胚胎干细胞的外泌体在体外促进了小鼠造血干细胞的存活和扩展，同时也上调了受体细胞中与多能性相关的转录因子。干细胞来源的外泌体与生物材料相结合，促进骨组织以及关节软骨的修复和再生。

在皮肤组织再生中，外泌体的应用尤其广泛。 如脂肪源外泌体能通过减少IFN-α的分泌而发挥免疫抑制作用，从而抑制T细胞的激活。此外，外泌体含有免疫调节蛋白如TNF-α、巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF） ，从而通过良好的炎症调节保证了伤口愈合。而在皮肤愈合过程中，外泌体则能通过优化成纤维细胞特性加速皮肤伤口愈合。在一项研究中发现，外泌体上调199个miRNA，下调93个miRNA，促进真皮成纤维细胞增殖和分化，加速皮肤再生。

图 6 外泌体促进皮肤细胞增殖

总而言之，干细胞来源的外泌体作用广泛。 在皮肤再生中，外泌体可以通过调控炎症、促进皮肤修复等多方面提供作用；在疾病发展中，外泌体也参与多种病理通路。 在未来，无论是组织再生、皮肤修复、还是疾病研究，外泌体都将在其中扮演重要角色。

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外泌体的缺陷

外泌体具有诸多优点，在医用再生中具有难以忽视的价值。然而，外泌体的应用却还有所局限。

最适用于提纯外泌体的超速离心法，在提纯得到外泌体的过程中会导致大量的外泌体损失，至少80%的外泌体会因为收集的损失或者在超离过程中其独特的磷脂双分子层的膜破碎而无法维持其正常形态。

此外，外泌体在提纯后其保存比较困难，需要保存的试剂具有与体液类似的渗透压从而维持其磷脂双分子层的膜结构，否则其内含的具有生物功能的蛋白质和miRNAs也容易失去活性。另外，外泌体起到信号传导作用，但本身并不会提供结构支持。因此，在修复领域，外泌体难以单独使用。

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细胞外基质：外泌体的最佳搭档

所有细胞均可分泌外泌体，外泌体充当着细胞之间信息交流的介质，因此外泌体生理功能的实现是通过一个细胞“出”而“进”入到另一个细胞内。在组织内部，必然要穿越细胞外基质。

因此，外泌体更适合作为细胞外基质的一部分来发挥价值，而细胞外基质的独特生理结构和生理稳态一来可以帮助维持外泌体的活性、二来也能与外泌体协同作用，实现更好的修复和再生效果。

细胞外基质是外泌体最理想的载体

在医用再生领域，科学家们研究各种各样的生物材料，并与外泌体进行复合促进组织的修复和新生。细胞外基质无疑是最安全的并且可以与外泌体协同发挥作用的生物材料。细胞外基质本身即源于人体，具有多元的组成 （胶原蛋白、弹性蛋白、层黏连蛋白等等） 。

一方面， 细胞外基质能够起到结构支持作用，作为承载材料提供组织再生的根基 ；另一方面， 细胞外基质中复杂的结构和靶点可以维持外泌体的活性，从而高效发挥外泌体的性能 。外泌体可以通过进入细胞内发挥其优异的生物学功能， 而细胞外基质作为载体即可以为细胞的黏附和迁移提供平台。如果没有细胞外基质所提供的平台，那么外泌体会很快随着体内的生理循环和代谢而流失，从而失去了其作用效果。众所周知，外泌体价格昂贵。 当外泌体由细胞外基质承载、由细胞外基质保护时，才会更好地提高其生物利用度 ，取得更好的修复效果。

细胞外基质提供适应的修复微环境

组织修复和再生，与细胞微环境息息相关。简单来说，微环境由两个基本组成部分组成，一个是细胞外基质 （ECM） ，而另一个是细胞分泌的外泌体、生长因子等功能性物质。二者缺一不可，彼此相辅相成、紧密结合。因此，光有外泌体，没有细胞外基质是远远不行的。

其实，除去细胞外基质 对外泌体的负载和保护作用，其本身也具备出众的再生和修复能力 。除了提供细胞存在的平台，细胞外基质的多元组成既可以为细胞的生理活动提供养分，并驻留在原位，成为机体自身的细胞外基质的一部分；又能够通过其本身的生物学特性来协同外泌体，实现更好的修复和再生效果。在经典的修复再生过程中，细胞外基质可以调节干细胞的表型和表达，而外泌体则含有控制干细胞分化的表型特异性指导因子 （miRNA，RNA和蛋白质）。

简而言之， 细胞外基质可以从拓扑结构、生物力学、功能靶点等多个维度与外泌体、生物因子共同作用，从而形成适于组织修复的胞外微环境。

首先，细胞外基质所含有的多种蛋白、多糖成分构建出其独特的三维结构和表面拓扑学特征。除支撑组织的生理形态外，还能够调控募集细胞的黏附、增殖和分化行为。近年来，人们更是发现细胞外基质构建的拓扑学结构与免疫细胞的免疫应答等行为息息相关，进而调控组织再生。

再者， 细胞外基质本身具有其独特的生物力学性质 。不同弹性模量、不同硬度的基质，能够引发细胞的不同表现行为和分化方向，也会引起细胞分泌和募集因子的不同。

细胞外基质极为多元的组成能提供不同的生物学效果，从而建立修复微环境 。举例来说，细胞外基质中的纤连蛋白因可与细胞表面的整合素蛋白的α5β1结合，充当修复过程中细胞与细胞外基质交流沟通的重要参与者，并且调控细胞的黏附、增殖、形态和分化等行为；蛋白聚糖通过参与调节细胞外基质的组装和维持，并通过与生长因子的相互作用参与细胞增殖等细胞行为，在组织的生理和生物力学功能中发挥重要作用。正是由于细胞外基质打下的坚实基础，才能让外泌体、细胞因子等活性成分进一步“锦上添花”。

另外，近几年研究中还发现，细胞外基质的结构能结合和锚定多种生长因子（如VEGF，HGF等）、多肽短链。一方面， 通过构型调整来更好地发挥其生物活性 ；另一方面，则能 形成生长因子梯度，从而介导修复和再生过程的进行 。可以想象，这是唯有细胞外基质才能实现的高度复杂而有序的生物过程。相比之下，仅仅使用外泌体完全无法实现上述空间上的介导过程。这也解释了为何直接使用外泌体或生长因子时，往往修复和再生效果并不如人所愿。

关于细胞外基质和外泌体之间的作用，目前依然还在不断研究中。然而，我们已经可以知道的是： 细胞外基质是组织再生的舞台，而外泌体则是舞台上的演员 。 演员可以让舞台更加 熠熠生辉 ， 但舞台却是整个根基所在 。 二者有机结合，则能带来最好的演出效果。

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细胞外基质/外泌体组合的应用

目前，细胞外基质/外泌体这一组合有了不少应用实例，其作用效果极为明显。

国外的研究中， 以细胞外基质中的胶原为支架组成并负载外泌体。 这一体系增加了外泌体在体内的保留时间、延长了释放过程，同时也在心脏组织的修复中取得了更好的效果。无独有偶，在另一项研究中，科学家则利用了仿细胞外基质的丝蛋白/壳聚糖复合体系，并通过慢性糖尿病患者皮肤创面愈合模型来考察了作用效果。可以发现， 这一仿细胞外基质和外泌体体系具有协同作用，能加速皮肤创面再生。

而国内的部分研究则更进一步，将“全成分”的细胞外基质、玻尿酸、外泌体结合，并考察了其在人体上的作用效果。从临床实验中可以发现，该体系能够显著淡化眼纹，令眼部更显年轻态。随着年龄的增加， 部肌肤胶原蛋 流失增加，弹性纤维 化断裂，基底层上真皮与表皮连接不再那么紧密。于是乎，就产生了各类细纹。而通过细胞外基质、玻尿酸、外泌体这一复合体系，一方面外源性途径引入了胶原、糖胺聚糖等重要基质成分，撑起来了眼周结构；另一方面通过其本身的生物学效应，内源性途径增加细胞外基质分泌。通过双管齐下的方式，迅速起效。

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文末小结

随着技术的进步，外泌体已经越来越被人们熟知，其应用也愈加广泛。外泌体是具有纳米尺寸的细胞囊泡，具有高生物活性，能参与细胞之间的交流，调控炎症水平、促进组织再生。然而，外泌体提取较为困难，本身也不具备结构性的功能，因此单独使用有所局限。

作为细胞外基质中的一部分，当外泌体回到细胞外基质中时，能够发挥出更为强大的作用，更起到“锦上添花”的效果。细胞外基质一方面是外泌体最理想的载体，帮助维持外泌体的活性；另一方面细胞外基质能够构建出最适宜再生的细胞外微环境，从而让外泌体能更加有的放矢。

目前，国内外相关的研究正如火如荼地进行中。相信，不久的将来，细胞外基质/外泌体这样的明星组合会越来越多地出现在我们面前。

参考文献

谁持彩练当空舞 ：干细胞基础与临床研究进展

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- 科普 情怀 责任 -