山东小鼠心肌原代干细胞分离培养（小鼠心肌细胞系）

本文目录一览：

• 1、完全培养基可以激活小鼠原代肝细胞吗
• 2、小鼠棕色脂肪前体细胞原代培养，怎样分离前体细胞
• 3、小鼠胚胎成纤维细胞的培养
• 4、细胞生物学：小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
• 5、请教小鼠原代脂肪干细胞的形态及分离培养条件

完全培养基可以激活小鼠原代肝细胞吗

一、实验目的：通过直接消化法分离小鼠肝细胞进行原代培养，从而得到体外培养的小鼠肝细胞，进行相关实验研究。

二、主要实验步骤：

1、 将小白鼠引颈处死后于含有75%酒精的大烧杯中浸洗10秒钟。

2、 用剪刀剪开小鼠腹部,迅速取出肝脏并将其放入装有4℃的含双抗的D- Hanks 液中进行漂洗2次，之后在培养皿中用眼科剪子将鼠肝组织剪成1mm3 左右的小块, 放入试管中， 用吸管吹打, 待组织沉淀后吸出上清, 如此反复3 次,最后一次清洗后，将试管放入离心机800rp/min离心4min。

3、 将离心后的试管取出后弃上清， 加入10倍肝组织体积的含0.2% Ⅳ型胶原酶和1%PVP的消化液后，封口，4℃冰箱过夜。

4、 次日检查肝组织是干细胞美容项目投资预算否消化完全，消化完全者可用吸管吹打散开, 若消化不完全而吹打不开者,可重于37 ℃消化15min。

5、 将消化完全的悬液经200目不锈钢网过滤到培养皿中，之后将过滤后的悬液装到一个5ml离心管中，之后向过滤后的悬液中加入含10%新生牛血清的DMEM培养基到5ml, 于4℃冰箱中静置20min 。

6、 用吸管弃除悬液, 加入DMEM培养基至5ml, 以1000 转/ 分离心4min , 弃上清，如此反复3 次。

7、 最后离心完后再加入2ml含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，收集肝细胞于培养瓶中，进行台盼蓝活细胞计数；

8、 最后加入相同的完全培养基, 调整细胞密度至5×105/ml，于37℃、5%CO2条件下培养。

10、10h 后首次换液, 换以含50ml/L的新生牛血清的DMEM培养液, 以后每48h换液一次并依次降低胎牛血清含量至1%。

小鼠棕色脂肪前体细胞原代培养，怎样分离前体细胞

（转载，仅供参考）

(1)取BAT cell 的Isolationbuffer

按1：1000向其中加入p/s，4°C保存。

Notice:

用前按1~2mg/ml比例向Isolationbuffer中加入collagenase(c5138)，用滤器过滤消化液，并置于37°Cwater bath预热。

(2) Steps:先热上medium(培养用,分离用,消化用)

1）将新生Mice泡入70%EtoH 中约5mins进行消毒；(出生后两天内)

2）剪开其肩部中间的外皮，两个镊子拨开皮肤,弯头镊子夹取其BAT（位于肩胛骨间的蝴蝶状组织，尽量勿取到其他多余组织）移入含PBS的60-mmdishes中；

3）用PBS洗2~3遍；

4）将BAT组织挑出来,在不含液体的情况下剪碎为1mm2的小块

细碎的组织装进3ml含collagenase的Isolation buffer中；37°Cwater bath中消化30mins

5）30min后将消化液用力甩，以使附着的cell散落；液体越浑浊说明震荡下来的细胞越多。

6）用筛网将消化液过滤至15ml 离心管中，离心：200g，5min，弃上清；

7）用Isolationbuffer（不含collagenase）吹起离心管底沉淀，混匀，离心：200g，5min，弃上清；

8）用5ml 20%FBS-DMEM medium重悬cell，接于60-mmdishes中，培养，次日先用培养液清洗下再换液；

取过很多次了干细胞美容针的作用和功效，只要小鼠是最新的免疫细胞疗法是什么出生2天内的就不会有问题的~！

小鼠胚胎成纤维细胞的培养

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 作为原代培养细胞，其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF传代次数有限，但可早期冻存一些，不断复苏，保持长期使用。MEF 的缺点是无法耐受G418 的筛选。替代方法是从持续表达neo抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF 。利用各种转基因鼠培养的MEF 细胞还是各种基因功能研究的良好工具。

（一）材料

12.5~14.5d 的小鼠胚胎(3~6 只小鼠／次），培养皿（ 直径10cm), DMEM+10%新生牛血清， 15cm 或50cm 离心管（圆底）， PBS 配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手术刀、镊子、剪子等器械。

（二）操作步骤

1. 一般操作

(1) 在培养皿中，解剖出鼠胚，以Hanks 溶液消洗。

(2) 除掉四肢、大脑及内脏（肝脏） 。

(3) 用无菌Hanks 溶液＋PBS 漂洗3 次。

(4) 置培养皿中，用手术剪切碎。

(5) 将剪碎组织移入50ml 离心管中，加入约10ml 消化液。

(6) 37°C摇育10min （置水浴或孵育箱中）。

(7) 吸5ml 上清液放入另一50ml 离心管中，加等体积含10％新生牛血清的DMEM 培养液中和胰蛋白酶。

(8) 再加入4ml 消化液至原离心管（内含组织），颠倒摇动，10min 后再吸出5ml 上清液到另一离心管中，加入5ml 含10% 新生牛血清的DMEM 培养液。

(9) 重复上一步骤5 次左右，此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。

(10) 离心50ml 离心管，加50ml 含10％新生牛血清的DMEM 培养液。

(11) 取适量移到培养皿或培养瓶中培养。

(12) 第二天换液，直到细胞长满（汇合），1 : 10 传代，再生长至合适密度时可进行冻存。

(13) 根据实验需要复苏细胞，由于MEF细胞传代数有限，实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。

2. 丝裂霉素处理或γ-射线处理 用作饲养层的MEF 细胞还须进行丝裂霉素处理或干射线处理，步骤如下。

（1） 丝裂霉素处理

复苏冻存的MEF 细胞(5×104个/cm2，保证用时满满一层，不留空间。

汇合状态下的MEF 加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml 丝裂霉紊的DMEM 培养液， 37 °C 、5% CO2培养箱中培养2~3h 。

以PBS 彻底漂洗数次，胰蛋白酶消化，以每分钟1000 转的速率离心5min,收集沉淀，用新培养液悬浮，调整浓度为3×105g 个/ml。

将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。（明胶预处理： 0.1％明胶溶液浸泡2h, 移走多余的明胶，待自然干燥。）

(2)γ-射线处理

汇合状态的MEF 细胞，以30~ 100Gy 的γ－射线处理。

胰蛋白酶消化，收集细胞，离心（每分钟1000 转， 10min )、计数，接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×106个／ml 的浓度冻存起来。复苏后， 1 支冻存管可接种到4~5 块直径6cm 的培养皿中。

细胞生物学：小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。

1、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态

培养基

细胞复苏

冻存细胞

明胶包被

细胞传代

2 、体外分化

培养基

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

体外分化方法

注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基

ES：

配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基——见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液

DMEM（高糖）

马血清（HS）

L-谷氨酰胺（200mM）

MEM NEAA（10mM）

HEPES（1M）

β-巯基乙醇（55Mm）

PEST

LIF

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：

1.从液氮中取出一管细胞；

2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3.将细胞转移到一15ml Falcon管中；

4.加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5.离心3分钟；

6.弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7.接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

8.孵育。

请教小鼠原代脂肪干细胞的形态及分离培养条件

小鼠脂肪来源干细胞的分离、培养及鉴定

脂肪来源干细胞（Adipose-DerivedStemCells,ADSCs)作为组织工程的种子细胞正受到越来越多的关注。 本实验采用一次消化多次收集与差速贴壁法分离小鼠腹股沟及附睾脂肪组织中的ADSC。通过倒置显微镜观察ADSC的一般形态；透射电子显微镜观察ADSC的超微结构；流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测ADSC表面标志；利用特定的诱导液诱导ADSC分化及利用扫描电子显微镜观察ADSC与胶原支架的相容性。 结果显示ADSC呈长梭形或成纤维细胞样，旋涡状或束状交叉生长。ADSC细胞体积大，胞质内含有线粒体及粗面内质网等细胞器。ADSC的生长符合干细胞的生长规律，并可在体外稳定传至第9代。ADSC表达CD44及CD29，不表达CD34。成骨诱导剂诱导后，细胞内碱性磷酸酶表达量增加，细胞基质发生钙化。成脂肪诱导剂诱导后，细胞质内可见较多小脂滴。说明ADSC具有分化为成骨细胞及脂肪细胞的潜能。ADSC能够在胶原支架上铺展生长，说明其与胶原支架具有良好的相容性。 本实验建立了分离、培养小鼠ADSC的技术方法，为将来利用小鼠ADSC进行皮肤、肌腱、血管及神经组织修复的动物实验研究提供了前期实验基础和技术支持。