小鼠神经干细胞传代培养（小鼠神经元原代细胞培养）

本文目录一览：

• 1、如何利用小鼠胚胎干细胞制作纯合转基因小鼠
• 2、小鼠胚胎成纤维细胞的培养
• 3、神经干细胞与神经元共培养时需要传代后共培养吗
• 4、动物细胞传代顺序
• 5、如何利用小鼠培育出可生育的后代？

如何利用小鼠胚胎干细胞制作纯合转基因小鼠

利用小鼠胚胎干细胞制作纯合转基因小鼠需要胚胎的培养。

哺乳类动物基因转移方法是免疫应答异常会自行恢复吗将液燃改建后的目的基因（或基因组片段兄核）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（或着床前的胚胎细胞），然后将此受精卵（或着床前的胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。

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小鼠胚胎成纤维细胞的培养

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 作为原代培养细胞，其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF传代次数有限，但可早期冻存一些，不断复苏，保持长期使用。MEF 的缺点是无法耐受G418 的筛选。替代方法是从持续表达neo抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF 。利用各种转基因鼠培养的MEF 细胞还是各种基因功能研究的良好工具。

（一）材料

12.5~14.5d 的小鼠胚胎(3~6 只小鼠／次），培养皿（ 直径10cm), DMEM+10%新生牛血清， 15cm 或50cm 离心管（圆底）， PBS 配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手术刀、镊子、剪子等器械。

（二）操作步骤

1. 一般操作

(1) 在培养皿中，解剖出鼠胚，以Hanks 溶液消洗。

(2) 除掉四肢、大脑及内脏（肝脏） 。

(3) 用无菌Hanks 溶液＋PBS 漂洗3 次。

(4) 置培养皿键物中，用手术剪切碎。

(5) 将剪碎组织移入50ml 离心管中，加入约10ml 消化液。

(6) 37°C摇育10min （置水浴或孵育箱中）。

(7) 吸5ml 上清液放入另一50ml 离心管中，加等体积含10％新生牛血清的DMEM 培养液中和胰蛋白酶。

(8) 再加入4ml 消化液至原离心管（内含组织），颠倒摇动，10min 后再吸出5ml 上清液到另一离心管中，加入5ml 含10% 新生牛血清的DMEM 培养液。

(9) 重滚亮链复上一步骤5 次左右，此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。

(10) 离心50ml 离心管，加50ml 含10％新生牛血清的DMEM 培养液。

(11) 取适量移到培养皿或培养瓶中培养。

(12) 第二天换液，直到细胞长满（汇合），1 : 10 传代，再生长至合适密度时可进行冻存。

(13) 根据实验需要复苏细胞，由于MEF细胞传代数有限，实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。

2. 丝裂霉素处理或γ-射线处理 用作饲养层的MEF 细胞还须进行丝裂霉素处理或干射线处理，步骤如下。

（1） 丝裂霉素处理

复苏冻存的MEF 细胞(5×104个/cm2，保证大孙用时满满一层，不留空间。

汇合状态下的MEF 加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml 丝裂霉紊的DMEM 培养液， 37 °C 、5% CO2培养箱中培养2~3h 。

以PBS 彻底漂洗数次，胰蛋白酶消化，以每分钟1000 转的速率离心5min,收集沉淀，用新培养液悬浮，调整浓度为3×105g 个/ml。

将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。（明胶预处理： 0.1％明胶溶液浸泡2h, 移走多余的明胶，待自然干燥。）

(2)γ-射线处理

汇合状态的MEF 细胞，以30~ 100Gy 的γ－射线处理。

胰蛋白酶消化，收集细胞，离心（每分钟1000 转， 10min )、计数，接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×106个／ml 的浓度冻存起来。复苏后， 1 支冻存管可接种到4~5 块直径6cm 的培养皿中。

神经干细胞与神经元共培养时需要传代后共培养吗

神经干细胞与神经元共培耐孙养时需要传代后共培养

传代细胞实质上也是细胞经原代培养后使之永生化不断传代而来。因此，传代细胞容易增殖，也容易存活磨肆，一般普通培养条件下都可以。 而原代培养是从活体组织或器官中分离单一细胞进行培养，过程相对复杂，培养条件要求也更高。原代神经元培养用出生多久的老鼠 原代培养（primary culture）又名初瞎亩轿代培养，是从供体取得组织细胞后的首次培养。其特点是细胞或组织刚离开机体，生物性状尚未发生很大的改变，一定程度上反映了它们在体内的状态，表现出原组织或细胞的特性。

动物细胞传代顺序

动物细胞传代培养的操作步骤

1.观察培养基是否正空岩常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。

2.加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3.打开宴亏迟超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。

4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的晌李方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5.取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6.用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8.将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。

9.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12.擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。

13.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

如何利用小鼠培育出可生育的后代？

英国《每日邮报》9日报道称，日本研究人员用雄性小鼠的皮肤细胞培育出卵子并使其受精，进而培养出7只有两个亲生父亲的小鼠。研究人员希望利脊凯唤用这项研究推动治疗不孕症的同时，帮助男同性关系中的伴侣诞下后代。资料图当地时间3月8日，在英国伦敦召开的第三届人类基因组樱凯编辑国际峰会上，来自日本九州大学的林克彦（katsuhiko hayashi，音译）教授介绍了该研究的孙梁详细情况。该技术包括首先从雄性小鼠身上获取皮肤细胞，将其转化为干细胞。然后删除其中的Y染色体、复制X染色体，将干细胞编辑成卵细胞。最后，拥有两个x染色体的这些细胞被放置在一个卵巢类器官中进行培养，从而形成卵子。当与正常精子受精后，科学家们获得了大约600个胚胎，并将其植入代孕老鼠体内。最终，代孕老鼠诞生了7只小鼠幼崽。有关报道据悉，这些小老鼠看起来很健康，会有一个正常的寿命，并在成年后得以继续生育后代。“它们看起来还不错，在正常生长，以后能够成为父亲。”林克彦表示，实验中约1%的生产成功率低于用正常女性卵细胞能够达到的5%的成功率。

林克彦表示，该研究的主要动机是希望能够为罹患不孕不育症的夫妻提供一种生育治疗方法，例如患有特纳综合征的妇女，她们拷贝的x染色体有一整个或部分缺失的情况。他继续补充，这项技术仍处于非常早期阶段，由于培育出的卵子质量不高，现阶段并不能安全地用于人类，但他预测，可望在十年内解决当前问题。然而，部分科学家认为这一时间估计过于乐观，因为目前在实验室条件下还未能从女性细胞中创造出可行的人类卵细胞。并且，也有科学家提出，人类的细胞需要更长的培养时间来产生一个成熟的卵细胞，这可能会增加细胞获得不必要的遗传变化的风险。

此外，林克彦还提出对社会是否能够接受这一技术的担忧。他并不赞同男性用自己的精子和人工制造的卵细胞来创造一个婴儿。“在技术上这是可能的。但是我ips诱导干细胞技术研究进展不太确定在现在这个阶段，它是否安全或为社会所接受。”他补充到。