单细胞测序技术原理（单细胞测序技术原理图）

本文目录一览：

• 1、前沿技术| 单细胞测序技术小讲
• 2、科普讲堂|什么是单细胞测序？
• 3、生命科学单细胞测序（10×genomics技术）的原理是什么？
• 4、单细胞测序技术
• 5、单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？

前沿技术| 单细胞测序技术小讲

【引言】 单细胞测序技术是21世纪生命科学领域的前沿技术，自诞生之日起就给科学的发展提供了很多新的发现，更是连续数年被Nature等顶级期刊评为“年度技术”。作为单细胞领域的技术从业者，

一、单细胞测序技术为什么如此火热

  细胞是生物体和生物过程的运作基础，在类型、行为和状态上有着广泛的差异（即细胞异质性）。传统的基因测序方法（Bulk RNA-seq）是对组织进行的检测，得到的结果是所有细胞的平均值，会忽略细胞之间的差异性，比如有的细胞转录水平比较高，有的细胞则比较低。同时如果目标细胞占比本来稀少，则这些细胞的信息会被平均或覆盖掉。

  单细胞测序技术很好的解决了bulk RNA-seq的问题，可以对单个细胞内的核酸（DNA或者RNA）进行捕获建库，因而获得单个细胞中的信息。单细胞分析（scRNA-seq）可以反映群体内细胞间的异质性和小群体细胞的重要功能，特别是细胞之间的细微差异也可以解析出。因此单细胞测序技术又被称为“分子显微镜”。

  单细胞测序技术最早兴起于2009年，由北京大学汤富酬教授提出并发表了第一篇单细胞文章。随后十几年以来持续不断地发展，尤其是近几年，单细胞测序出现了爆发式的发展和普及。2011年，《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。2013年，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，《Nature Methods》杂志将单细胞测序的应用列为2013年年度最重要的方法学进展。2017年10月16日，与 “人类基因组计划” 相媲美的 “人类细胞图谱计划” 首批拟资助的38个项目正式公布，引爆单细胞测序新时代。

二、单细胞测序技术原理

  目前有两种方式可以实现单细胞测序。一种是通过显微方式直接获得单个细胞，并将其内部的核酸物质获取出来进行文库构建。代表性的技术有smart-seq2，采用流式方法进行单细胞的分离获取。不过将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。

  另一种方式是引入分子标签（barcode）技术，在单细胞分离的同时给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序后分析的时候就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。通过一次建库可以测得数百上千个单细胞的信息。此外，mRNA种类的含量在很大范围内变化，扩增可能会引入额外的偏差，阻碍mRNA拷贝的精确计数，因此又引入了独特分子标识符（unique molecular identifiers，UMI）随机序列，在扩增前作为独特标签标记不同的mRNA分子，允许区分原始分子和扩增重复序列。

  目前针对单细胞建库测序的步骤是基本统一的。scRNA-seq实验主要涉及以下几个模块化步骤：单细胞悬浮液制备、单细胞分离和裂解、mRNA提取、mRNA逆转录（RT）到cDNA、测序文库构建，以及使用计算工具进行数据分析。

  随着单细胞技术相关研究的深入，scRNA-seq的应用已从基础研究扩展到临床研究，如构建生物体基因表达图谱、重建细胞发育谱系、发现疾病生物标志物、肿瘤免疫微环境分析和临床诊断等领域。

三、单细胞测序技术的技术挑战

  1）准确、快速地分离单个细胞；2） 从单个细胞中扩增微量RNA；3）提高大规模并行处理的细胞吞吐量，同时降低单独文库准备和测序的预算。4）scRNA-seq方法仅限于多聚腺苷酸mRNA分析，而非多聚腺苷酸RNA物种，包括非编码RNA和RNA修饰，目前的scRNA-seq方法尚未进行探索。5）缺少实验和计算方法的质量控制和标准化的共同基准。6）空间转录组的分辨率仍未实现真正单细胞水平。

四、参考文献

1、Tang Fuchou, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6(5):377-82(2009)

2、Tang, X., Huang, Y., Lei, J. et al. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell Biosci 9, 53 (2019)

3、Li H. Single-cell RNA sequencing in Drosophila: Technologies and applications. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2021

4、Chen Y, Song J, Yang C, et al. Single-Cell Sequencing Methodologies: From Transcriptome to Multi-Dimensional Measurement. Small Methods. 2021

科普讲堂|什么是单细胞测序？

简介

单细胞测序技术，简单来说，就是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术。传统的测序，是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息，从而很好的解决了这一问题。

单细胞测序技术自从2009年首次问世，在这十几年以来持续不断地发展。尤其是近几年，单细胞测序出现了爆发式的发展和普及。2011年，《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。2013年，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，《Nature Methods》杂志将单细胞测序的应用列为2013年年度最重要的方法学进展。2017年10月16日，与 “人类基因组计划” 相媲美的 “人类细胞图谱计划” 首批拟资助的38个项目正式公布，引爆单细胞测序新时代。

单细胞表达谱测序与 bulk RNA测序对比

传统的二代测序中，最为人熟知的就要数RNA-seq了（图2）。RNA-seq是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA(bulk RNA)进行测序，能够得到的是一群细胞的转录组的平均数据，细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖（比如特异表达的基因或RNA不同的剪接体）。而随着对生物结构功能的深入研究，人们越来越清楚地认识到，哪怕看似相同的细胞群，细胞之间的转录组表达水平也是存在差异的。以肿瘤为例，肿瘤中心的细胞，肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞，乃至远端转移的细胞，其转录组等遗传信息一定是存在差异的，而传统的研究手段通常将整个肿块整体进行研究，或者将肿块简单分区分割，得到每一部分细胞基因表达的平均值，丢失了每个细胞的异质性信息，使科研人员对肿瘤微环境中各种细胞转录组表达及免疫功能的理解和认识始终无法深入。

由此可见，为了得到原始和真实的细胞遗传信息，对转录组的分析须在单细胞水平上展开。单细胞表达谱测序技术可以从混杂组织中捕获单个细胞，并能从中够获取单个细胞的表达信息，检测出混杂样品中细胞的异质性数据。目前单细胞的捕获策略大体分两种：

· 早期的单细胞捕获方式

早期的单细胞获取方式，是通过一定的技术手段，将单个细胞分离出来，并利用SMART-Seq2或商业化的SMART-Seq4试剂独立构建测序文库，最终进行测序。捕获方式包括：有限稀释法，流式分选法，激光切割法，显微操作法（图3前四种）。这些方法虽然各有各的优点，但各自的缺点也十分明显，比如流式分选法对于难度的计算易存在误差；流式分选法不适用于微量样本；激光切割法操作复杂；显微切割法的细胞通量低等。而它们的共同缺点，就是捕获成本高。

· 使用微流控技术获取单细胞

通过微流控芯片将单个细胞捕获至油滴（图3最后一种），就是微流控技术。这种方式的优点是细胞通量高，周期快速，成本低，细胞捕获效率高，并且商业化仪器操作简便。其核心思想是将不同的细胞赋予一段不同的barcode序列，建库时，携带相同barcode序列的核酸分子被认为来自同一个细胞，人们就可以一次性为成百上千的细胞建库并顺利区分它们。

以目前占全球95%市场份额的10X Genomics Chromium转录组测序为例，细胞与逆转录试剂预混在一起，通过微流控芯片的一条通道，与另一通道中的携带百万个不同标签（barcode）的凝胶珠（gel beads）相遇，穿过油幕的同时被包裹在一个油滴中，便可以轻松得到一个细胞和一个凝胶珠包在一起的油包水滴GEMs（图4）。

对于3’单细胞转录组来说，每一个凝胶珠携带足量条的核酸链，而每条核酸链由read1 primer，细胞标签（barcode），分子标记（UMI），poly(dT)组成。一个凝胶珠上所有的核酸链的细胞标签（barcode）是相同的序列，而不同于其他凝胶珠上的细胞标签（barcode），用于标记细胞。一个凝胶珠上所有的核酸链的分子标记（UMI）是不同的，用于标记不同的RNA序列（图5）。

逆转录在油包水隔离的小室中进行，细胞破裂释放出mRNA，其3’端poly(A)序列被凝胶珠上的poly(dT)捕获。这样，同一个细胞的mRNA带有同一个细胞标签（barcode），可以与别的细胞的mRNA区分开；每条mRNA带有不同的分子标记（UMI），可以用来计算不同基因转录本的拷贝数，避免PCR扩增偏差（图6）。之后，对单个样本进行cDNA回收、建库和测序，分析测序下机数据识别barcode，得到单个细胞的表达矩阵、分群等信息。

由于这种单细胞检测平台的出现和商业化，使得单细胞测序技术的使用门槛大大降低，不仅实现了细胞通量（实际测到的细胞数量）的飞跃，而且大幅降低了单个细胞的检测成本。

单细胞测序的应用

单细胞测序技术，是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点。

随着精准治疗时代的到来，未来单细胞技术，将会有助于人类的科学研究以及临床应用，尤其是在肿瘤、微生物、神经科学、免疫学等领域，应用会越来越广泛。

· 肿瘤研究上的应用

2021年6月15日，Cell杂志发表了一篇通过单细胞分析探测肿瘤的血管选定研究的文章。该研究采用了单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)，对31964个具有AAT（抗血管生成）抗性小鼠的肺肿瘤血管内皮细胞（TECs）和周细胞进行了检测。结果显示实验组与健康对照组的TECs和周细胞的表达谱都非常相似。同时还发现基质重塑巨噬细胞有助于浸润性癌细胞的血管选定；M1样巨噬细胞亚型可使血管细胞保持静止。

该研究重在体现对抗VEGF（血管内皮生长因子） 阻断 AAT时，肿瘤血管选定的临床重要性，而且有助于确定肿瘤血管的细胞表型，从而在研究抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤细胞的生长和转移的道路上向前迈进了一大步。

· 新冠治疗研究中的应用

2020年7月，北京大学谢晓亮团队在Cell上发表了一篇关于新冠病毒特效药的文章。此项目首先从60名新冠康复病人的血液中分离出B细胞，利用单细胞转录组+单细胞BCR测序技术对这些B细胞进行检测，筛选出8558种病毒蛋白结合抗体序列，并找出14株高活性的中和抗体。之后进行小鼠实验，最终成功筛选出一种非常有效的中和抗体BD-368-2。经实验证实，此中和抗体可以大幅度提升新冠治愈率，缩短治愈时间，甚至可以提供短期的病毒免疫，在治疗和预防方面都发挥重要作用。

· 阿尔兹海默症研究中的应用

2019年5月,Nature报道，通过对24名阿尔茨海默病人和24名正常人尸检大脑样本的8万个细胞进行单细胞转录组测序。研究不仅分析出兴奋性和抑制性神经元，还分析稀有的非神经元脑细胞，如少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。这些细胞类型中的每一种在阿尔茨海默病患者中都表现出明显的基因表达差异。其中，轴突再生和髓鞘形成相关的基因在阿尔茨海默症中表现出明显差异。

单细胞测序的未来

目前，全球潜在科研市场体量已经达到130亿美元以上，单细胞测序技术的市场更以年均20%以上的速度逐年增长。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔。随着测序技术的发展和测序水平的提高，单细胞测序技术能够解析细胞间更加细微的差异，正在推动癌症及肿瘤研究、发育生物学、微生物学研究、免疫、以及神经科学领域向前发展，并逐渐成为生命科学研究的焦点。

如今，单细胞测序正如火如荼，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解转录组、免疫组和表观组的多样性。我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进！

生命科学单细胞测序（10×genomics技术）的原理是什么？

蓝海大脑生命科学冷冻电镜工作站研究人员表示：

单细胞 RNA 测序（Single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用 RNA 测序对特定细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。待测组织经过单细胞分离、RNA 提取、逆转录、文库构建和测序，便可利用数据分析获得多个细胞的基因表达谱。

1.单细胞测序与普通转录组测序的区别

普通转录组使用细胞混合物组成的样品进行测序，因此只能估计基因在细胞群中的平均表达水平，没有考虑样本中各个细胞的基因表达的异质性。无法分析早期发育组织或复杂组织的异质系统（如大脑组织等）。为克服这一限制，开发了单细胞水平的转录组测序技术（scRNA-seq）。

2.单细胞测序的原理

单细胞测序技术以单个细胞作为对象，通过对单个细胞遗传物质均匀扩增，标记建库后进行测序，最后对单个细胞基因组或转录组展开数据分析，其技术原理主要包括单细胞分离、扩增测序和数据分析3方面。

单细胞分离：主要包括荧光激活细胞分选法( flow- activated cell sorting ，FACS) 以及微流控分选法( microfluidics) 等。市场上，较成熟的商业单细胞测序公司主要有 10X Genomis 公司 的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。

3' 端文库的构建

通过10×genomics仪器将单个细胞与单个凝胶微珠通过油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下来把细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来。游离出来的mRNA与小液滴中的水相混合，也就是和逆转录酶、结合在凝胶微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接触。接着，发生逆转录反应。mRNA与凝胶微珠上带标签的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA来。

scRNA-seq 非常适合研究细胞群的异质性。例如，识别组织的细胞类型，定义不同细胞类型的"转录指纹"，研究细胞分化，探索疾病或环境因素导致的细胞组成变化等。

单细胞测序的经典流程：分离单细胞（核），将RNA转换为cDNA，准备测序文库（illumina）后测序。

SMART-seq2是一种低通量单细胞测序法，提供全长转录组的定量，适合研究小细胞组（如差异isoform使用，低表达转录本的特征）。

10x Chromium是一种高通量方法，使用UMIs进行定量，适合研究高度异质组织和大量的细胞样本。

单细胞测序技术

单细胞测序的知识

系统学习单细胞转录组测序scRNA-Seq(一)

单细胞测序方法包括多种，区别在于两方面：定量方法，tag标签或全长；捕获策略，微孔microwell-，微液流microfluidic-,微滴droplet-。

微流控平台

主要包括顶部的微孔装置和底部的微流控通道。微孔大小可根据需要改变，当捕获到细胞后，翻转装置，能继续培养细胞系。

视频链接

建库过程包括：裂解细胞，游离RNA与附有BC、UMI及接头序列的磁珠连接在引物作用下完成cDNA第一链合成，而后cDNA第二链合成，最后扩增。测序方法通常是Illumina Hiseq技术。

因为有BC（Bead Code）序列，在后期定量时就能够区分该序列属于哪个细胞，从而获得单个细胞文库的测序定量结果。

目前有两种定量方法，基于tag和基于全长。前者对3'端RNA序列测序，通过UMI定量序列，因而对低丰度RNA仍获得比较好的定量结果，但是对分析isoform并不友好；后者获得一致的read 序列，通过序列覆盖度定量，此方法对高表达RNA定量准确性更好。

Smart-seq2 method

UMI method

micro-well

sci-RNA-seq3

单细胞测序的两个主要难题是，细胞分选及细胞表达文库构建。细胞分选可依据细胞大小、细胞自身电荷属性、细胞与抗体特异性结合等。得到单个细胞即对其打上标签，而后将细胞裂解，根据需要以tag或全长方式构建文库进行测序。

单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？

一、什么是单细胞测序？

如果简单地说，单细胞测序就是获取单个细胞遗传信息的测序技术，似乎没有多大的帮助。为了理解这个问题，咱们不妨先来了解一下测序技术到底可以做些什么。

目前，测序可以回答以下6类问题：

1. DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；

2. DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；

3. RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；

4. RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；

5. 染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；

6. 其他魔性应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。

单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。

二、为什么要使用单细胞测序？

如果把这个问题换个姿势来问，那就变成，为什么非用单细胞测序不可？

世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。

比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的差异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。

又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在差异的。而这种差异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。

这就是所谓的 遗传信息的异质性 。

传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。为了让大家能够更加直观地理解这个问题，我们不妨来看下面这张图：

为了检测某个蛋白质的表达量，我们可以用Western blot和流式细胞术来实现。但是，用Western blot的话，我们并没有办法区分上述的情况：目的蛋白只在10%的细胞中强表达，还是在50%的细胞里中等表达，还是在所有细胞中弱表达呢？因为最终电泳跑出来，就是一条差不多强度的带。但如果用流式细胞术这种在单细胞水平对荧光强度加以测定的技术，就能区分上述的情况了。

同样道理，单细胞测序能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。而这将带领整个遗传学领域进入新的次元。

三、如何实现单细胞测序？

目前主要有两种策略来实现单细胞测序。

第一种，也就是目前大多数人所想象的那样，将单个细胞分离出来，并独立构建测序文库，最终进行测序的路线。我们可以通过流式细胞术（含微流体芯片），或者激光捕获显微切割（LCM）来实现。流式细胞术估计大家比较熟悉，就不多讲了，它主要运用于细胞样品。对于组织切片样品来说，主要是通过LCM来获取单细胞，原理可以见下面的示意图。

不过，将单细胞挨个分离出来再分别建库测序，通量非常低，这主要受成本的限制。随着待测单细胞的个数的增长，测序的成本也会几乎呈线性提升。通常做十几二十来个细胞，就要烧掉很多钱了。然而，这数十个细胞，就足够说明问题了吗？

为了克服这个困难，近年来多采取第二种策略：基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

不过，针对具体的测序类型，给细胞加barcode的方案是有不小的区别的。对于RNA（转录组mRNA）来说，会比较容易理解一些。由于mRNA测序前需要做逆转录，那么我们只需要在poly T引物的5’端加入barcode即可。具体可见下面的示意图（来自文献doi:10.1038/nprot.2016.154）：

首先将单细胞悬液样品和带有barcode的水凝胶珠子，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了（蓝色部分）。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别barcode，区分单细胞。

如果测序对象是DNA，比如全基因组，就需要用别的方式来加barcode。目前主要是通过一种经过改造的高效转座酶（transposase）Tn5来实现。

基因转座是指转座子DNA从一个染色体座位“跳跃”到另外一个座位的过程。在这个过程中，有转座酶的参与。单细胞的DNA测序就利用了这个特性，将barcode DNA预先和转座酶Tn5组装好，再通过上述的微流体技术，将细胞和转座复合物包裹在一个油滴之中。随后，转座酶会把barcode插入到基因组DNA之中。这个过程在文献中也被成为tagmentation。

不过，基于Tn5的barcode复杂度（即能有多少独一无二的barcode）还是比较有限的。为了保证tagmentation的效率，上图中红色的barcode区域不可以过长。同时，为了避免测序错误带来的误识别（如偶尔测错了一个碱基，但却被当成另外一个barcode），barcode的复杂度也不是4的n次方那么高，需要引入校正机制。具体就不展开讲了。总地来说，仅靠Tn5来做单细胞，一次往往仅能识别数十到数百个单细胞。

为了提高复杂度，即一次能够捕获的单细胞数目，目前的解决方案是走组合索引（combinatorial indexing）路线。（见下图，来自文献doi:10.1038/nmeth.4154）

它的主要思路是，通过两步反应，加两次标签。首先，将单细胞悬液放在多孔板中，并用转座酶Tn5给细胞加第一个barcode，这里每个孔中的barcode是不同的。然后，再将样品混合起来，通过流式细胞术，将少量的细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中。而这些引物是带有第二轮barcode的。因此，经过Tn5的转座，和PCR加标签，绝大部分的细胞就能带上独一无二的barcode了。

读到这里，肯定有人发现这个方案存在的问题。举个例子，万一在流式分选时，在第一个孔里分了两个或以上橙色细胞，然后又通过PCR被加上了红色的标签，那这两个单细胞就无法被区分开来了。

确实如此，combinatorial indexing大概会有10%的撞车率（collision rate），即约有10%的机会把两个单细胞被误认为是同一个。这个数值的高低，取决于第一步tagmentation的复杂度（复杂度越高，撞车率越低），以及在分选时，分到每一个孔里的细胞数量（数量越低，撞车率越低）。但是，combinatorial indexing却能一次识别数千个单细胞，将通量提升数十至上百倍。鱼与熊掌，就看实验者的取舍了。

单细胞测序扫盲：是什么？为什么？怎么做？