外泌体circRNA研究套路（外泌体circRNA）

本文目录一览：

• 1、早期胃癌和癌前病变的诊断新方法，与旧方法比有哪些优势？
• 2、纯生信分析套路 综述|癌症中m6A与非编码RNA之间相互作用新见解
• 3、2021-03-03 基于lncRNA的功能富集分析——lncSEA
• 4、什么是NK细胞外泌体？
• 5、circRNA研究应用专篇①：“sponge”与“biomarker”

早期胃癌和癌前病变的诊断新方法，与旧方法比有哪些优势？

早期胃癌内镜或手术治疗的总生存率可超过 96%，而西方世界的大多数胃癌病例都是在晚期确诊的，累积 5 年生存率范围为 20-40%。通常，早期胃癌没有任何症状，因此降低晚期胃癌死亡率的办法是及时发现，无论是通过胃镜检查还是无创检查。

传统肿瘤标志物

癌胚抗原 (CEA) 和传统肿瘤标志物，即糖类抗原 72-4 (CA 72-4)、糖类抗原 19-9 (CA 19-9)、糖类抗原 15-3 (CA 15-3) 和糖类抗原12-5 (CA 12-5)主要用于治疗监测和预后判断，而不是早期检测或筛查胃癌。尽管在胃癌中可以发现它们的水平升高，但它们既不敏感也不特异，而且它们通常在疾病晚期升高。

胃黏膜萎缩标志物

胃蛋白酶原

胃蛋白酶原可在血液中作为胃粘膜变化的间接标志物进行测量。 胃蛋白酶原 I (PgI) 和胃蛋白酶原 II (PgII) 两种同工酶原在胃的不同部位产生。胃蛋白酶原I 的产生仅限于胃体（近端胃）的分泌酸的腺体，而胃蛋白酶原II广泛存在于整个胃的不同类型的腺体以及十二指肠的 Brunner 腺体中。 粘膜炎症的存在，以及幽门螺杆菌感染，可能会增加 胃蛋白酶原I 和 胃蛋白酶原II 的水平，并且在某些情况下，当萎缩和炎症都存在时，会导致胃蛋白酶原I 值正常。 考虑到这一缺点，胃蛋白酶原I 与 胃蛋白酶原II 的比率降低 (胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原II) 被认为是胃萎缩的最佳血清学标志物。

应该认识到，胃蛋白酶原检测正在使用不同的方法（乳胶凝集、ELISA、化学发光酶免疫测定）。 尽管使用不同方法获得的结果之间存在良好的相关性，但在绝对数字中，结果可能会有所不同。 因此，必须针对所使用的方法专门确定临界值，可能还要在不同人群中进行调整。

一些荟萃分析已经解决了胃蛋白酶原检测在胃癌检测中的准确性。初步荟萃分析包括 42个数据集，包括基于人群的筛查研究，涉及 296,553 个人。包括来自亚洲（主要是日本）的多项研究。在评估胃蛋白酶原对胃癌检测的性能时考虑了 25 项研究。 合并胃癌的敏感性为 77.3%，特异性为 73.2%。另一项荟萃分析包括1520例胃癌 案例。结果表明，胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原II 检测癌症的汇总敏感性为 0.69，特异性为 0.73。

胃泌素17

最近提出了一个额外的标志物来表征胃窦部分的萎缩：胃泌素 17 (G-17)，因为它仅由器官这一部分的 G 细胞分泌。 当存在胃窦部萎缩时，G-17 水平预计会降低； 然而，萎缩的受试者的水平可代偿性增加 。 此外，循环中的 G-17 水平对生理刺激敏感，包括食物和药物摄入（例如质子泵抑制剂类胃药）。 这将检测胃窦部萎缩的测试值降低到远低于筛选测试可接受的灵敏度水平。 在近端和远端局部胃癌之间也没有发现 G-17水平的差异。 因此， 目前从研究该指标用于胃癌筛查的作用有限。

G-17 经常与胃蛋白酶原和幽门螺杆菌血清抗体检测联合使用。荟萃分析总结了在萎缩性胃炎中的研究结果，但不是针对胃癌检测的结果。 分析涉及 4241 名受试者，合并的敏感性为 74.7%，萎缩的特异性为 95.6%。

自身免疫性胃炎的标志物

自身免疫性胃炎患者发生胃癌的风险增加，因此建议识别这些人群并进行监测。 尽管自身免疫性胃炎的血清学检测在常规中被广泛使用，但目前还没有针对这种情况的无创检测策略的“金标准”。

胃壁细胞抗体(APCA)是质子泵 a 和 b 亚基的靶标，也被认为是胃粘膜萎缩的标志物。 胃壁细胞抗体被认为是自身免疫性胃炎的标志物，胃壁细胞抗体的存在与胃体部分的萎缩有关； 它们可能先于作为恶性贫血的胃体炎的临床表现。

内因子 (IF) 是由位于胃体和胃底的壁细胞（泌酸细胞）产生的糖蛋白。 抗内在因子抗体 (anti-IFA) 已被视为恶性贫血的标志物，出现在萎缩性胃炎的后期。 抗 IFA 似乎非常特异，但对萎缩性胃炎检测的敏感性较低。

因此，目前自身免疫性胃炎和相关疾病的诊断策略包括上述血清学标志物以及巨细胞性贫血的存在，检测低维生素 B12 水平、幽门螺杆菌状态和胃粘膜组织学评估。

新兴的基于血液的生物标志物

在过去的十年中，出现了各种其他基于血液的生物标志物检测，通常称为液体活检。 液体活检是用于分析癌细胞或癌细胞衍生分子的血液或其他生物流体样本。 它们是传统组织活检的一种非常有前景的替代方法，可用于癌症的早期检测和随后的预后、监测疾病进展和跟踪肿瘤演变。 液体活检中最常见的分析物是循环肿瘤细胞 (CTC) 和循环无细胞核酸，包括循环肿瘤 DNA、甲基化标志物、无细胞 mRNA、miRNA、lncRNA 和其他 RNA 种类。 最近，细胞外囊泡 (EV) 已成为液体活检的癌症衍生生物标志物的替代来源。

循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞是从原发性或转移性肿瘤脱落到癌症患者外周血中的播散性癌细胞。 它们可能以单个细胞或 2-50 个癌细胞簇的形式存在，并且代表血液转移的重要步骤。 虽然几项研究一致证明 循环肿瘤细胞 的计数和/或分子分析可用于预测 胃癌 患者的总体和无进展生存期以及监测治疗反应，但目前，它们与 胃癌 早期检测的相关性存在争议。 循环肿瘤细胞 是一种罕见且异质的肿瘤细胞群； 因此，不同的 循环肿瘤细胞 检测方法产生了不同的检测率。 多项研究表明，胃癌患者血液中的循环肿瘤细胞检出率和循环肿瘤细胞数量低于其他癌症 ，如前列腺癌或乳腺癌，从而构成了利用它们进行早期检测的生物屏障。研究人员使用 CellSearch 系统（美纳里尼硅生物系统公司，美国）发现，只有三分之一的可切除胃癌患者每 7.5 mL 血液中至少含有 1 个 循环肿瘤细胞。使用基于尺寸的分离技术，发现在 I 和 II 阶段的 胃癌 中，循环肿瘤细胞 检测率分别为 33.3% 和 50%。另一项研究表明，转移性疾病患者的循环肿瘤细胞 数量明显高于非转移性疾病患者，并且与晚期肿瘤分期相关。 同时，使用称为“FAST 盘”的离心微流体系统，该系统基于通过膜孔对 循环肿瘤细胞 进行大小选择性分离，在 80% 的 T1 期和 N0 期 胃癌 患者中检测到 循环肿瘤细胞。使用基于过滤的方法，然后与上皮和间充质转录物的探针进行多重 RNA 原位杂交，表明在 胃癌 患者血液中发现的大多数 循环肿瘤细胞 具有间充质表型。 当同时计算上皮细胞和间充质细胞时，淋巴结阴性 胃癌的检出率为 77.3%，无远处转移的患者的检出率为 83.3%。 具有间充质表型的 循环肿瘤细胞 无法通过基于捕获表达上皮标志物（如 EpCAM 或细胞角蛋白）的细胞的方法检测到，因此在使用 CellSearch 系统或类似方法的研究中可能低估了 循环肿瘤细胞 的数量。 总之， 最新研究表明循环肿瘤细胞可能具有早期检测胃癌的潜在用途，捕获和分析异质循环肿瘤细胞群体的新方法值得进一步研究。

循环肿瘤DNA

DNA 片段从体内的各种细胞类型释放到循环中。 在癌症患者中，一部分无细胞 DNA (cfDNA) 来自肿瘤细胞，称为循环肿瘤 DNA (ctDNA)。 循环肿瘤 DNA 可用于检测肿瘤细胞中的体细胞点突变、重排、拷贝数变异和甲基化标志物，因此可用于癌症的非侵入性检测、监测治疗反应和疾病进展以及跟踪肿瘤内异质性和进化。 已在晚期和早期癌症患者中检测到 循环肿瘤 DNA，但是早期癌症患者 cfDNA 总库中循环肿瘤 DNA的比例通常很低，这代表了使用基于循环肿瘤 DNA 的主要技术挑战用于癌症早期检测的测试。 大多数分析循环肿瘤 DNA 的研究都使用基于 PCR 的方法或基于下一代测序 (NGS) 的方法。

液滴数字 PCR (ddPCR) 允许对生物流体样本中含有突变的 DNA 片段进行绝对定量，检测限低于野生型等位基因背景中 0.1% 的变异等位基因分数 (VAF) . 它是跟踪已知点突变和拷贝数变异的首选方法，例如患者的 HER2 扩增已经被诊断出患有胃癌。 然而，它需要对肿瘤突变情况的先验知识，因此它在早期检测或筛查方面的潜力有限。

相反，基于 NGS 的方法允许检测 循环肿瘤 DNA中的肿瘤特异性遗传或表观遗传改变，而无需事先了解肿瘤中存在的改变，因此对于检测癌症的存在和跟踪癌症的克隆进化，治疗或疾病进展期间的癌症具有潜在的相关性。然而，传统 NGS 方法的检测限约为 1% 的 VAF，当 循环肿瘤 DNA 比例相对较高时，这足以跟踪晚期疾病中的肿瘤突变，而如果 循环肿瘤 DNA 比例较低，则不适合。 因此，基于 NGS 的技术需要优化和改进以适用于早期癌症的检测。 最近，已经开发了几种用于检测可切除癌症的新型基于 NGS 的血液测试。

CancerSEEK 是一种血液检测，可以通过评估循环蛋白水平和 循环肿瘤 DNA 突变来检测八种常见的癌症类型，包括 胃癌。该检测在 1005 名患有卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、肺癌或乳腺癌的可切除 I-III 期癌症患者和 812 名 健康 个体中进行了测试。 结果显示，检测卵巢癌和肝癌的灵敏度为 98%，检测 胃癌 的灵敏度为 70% 左右，而特异性大于 99%。 重要的是，CancerSEEK 测试可以在 63% 的病例中正确识别癌症的解剖部位（并且在 83% 的病例中定位到两个可能的解剖部位）。

另一种最近开发的血液测试称为 PanSeer，它基于通过靶向亚硫酸氢盐测序检测 循环肿瘤 DNA 中癌症特异性甲基化模式。 该测试询问了 595 个已知包含差异甲基化 CpG 位点的基因组区域，这些位点可以将癌症与 健康 组织区分开来。 当应用于诊断后的血浆样本时，它可以检测五种常见的癌症（胃癌、食道癌、结直肠癌、肺癌或肝癌），灵敏度为 88%，特异性为 96%，而不管其来源如何。 此外，早期和晚期癌症的敏感性相似。 接下来，对 605 名无症状个体（其中 191 人在抽血后四年内被诊断出患有这些癌症类型之一）的检测显示，诊断前血浆样本的敏感性为 95%。 因此，这项研究表明，包括胃癌在内的常见癌症在使用标准护理方法进行诊断之前最多可以检测四年。

另一个必须考虑的方面是 cfDNA 中的一小部分遗传改变可能来自与年龄相关的克隆造血扩增。 为此，开发了一种策略来区分 循环肿瘤 DNA 改变和与克隆造血相关的变异。 来自 50 名可切除 胃癌 患者的匹配 cfDNA 和白细胞的靶向深度测序 (30 000) 显示 62% 的患者存在白细胞衍生的序列改变。 重要的是，在 白细胞中最常受影响的基因是 DNMT3A (45%)、TP53 (29%)、EGFR (10%)、APC (6%) 和其他常见的癌症基因，这些变异的中位 VAF 为 0.31%，这类似于癌症特异性变异。过滤白细胞衍生的变异后，54% 的患者发现 cfDNA 中存在癌症特异性突变，这与手术后疾病复发密切相关。

总之，最近的研究表明，通过 循环肿瘤DNA 分析检测早期 胃癌 是可行的，并且最近开发的一些检测方法显示出非常高的灵敏度和特异性。 然而，必须去除源自 白细胞克隆扩增的混杂序列变异，以识别真正的癌症衍生序列变异，并且应在将此类检测整合到常规临床实践之前证明其临床实用性。

无细胞RNA

2008 年，一项原理研究证明， 表明 miRNA 从癌细胞释放到血流中，在那里它们受到保护，不会降解，并且很容易通过基于 PCR 的方法检测到 。 与此同时， 人血清中含有不同的疾病特异性 miRNA 模式，这些模式在 健康 对照中是不存在的，并表明几种疾病可能会在患者血液中留下特定的 miRNA 指纹 。 从那时起，在癌症患者的各种生物体液中研究了个体 miRNA 或 miRNA 特征的水平，并与疾病状态、阶段、侵袭性和对治疗的反应相关联。 大约一百篇出版物报道了在胃癌患者中检测循环无细胞 miRNA。 其中一些研究报告了 miRNA 面板的鉴定，显示出非常高的诊断价值。

然而，在多项研究中，少数 miRNA 显示出一致的结果，而许多其他 miRNA 的报道结果相互矛盾。 结果不一致和重现性差的主要原因是队列规模小、前瞻性研究缺乏验证、RT-qPCR 结果的不同归一化方法以及血液样本收集和处理的可变条件。

最近，发表了一项广泛的三阶段研究，以解决早期研究的缺点。在第一阶段，通过 RT-qPCR 在 236 个 胃癌 病例和 236 个匹配的对照受试者中量化了 578 个候选 miRNA。 在第二阶段，在 AUC 为 0.92（I-II 期 胃癌 的 AUC 为 0.91）的两个独立病例对照队列中，选择并验证了一组显示最高 AUC 的 12 个 miRNA，分别为 89 和 121 名受试者。 最后，在 4566 名参与者的前瞻性验证队列中制造并验证了临床级 12-miRNA 检测，这些参与者接受了胃镜检查和基于血清的 胃癌 检测生物标志物测试（幽门螺杆菌血清学、胃蛋白酶原 I/II、Pg 指数、CEA 和 CA19-9）。 12-miRNA 面板将 胃癌 与 健康 对照区分开来，AUC 为 0.848（灵敏度为 87%，特异性为 68.4%），而其他生物标志物测试显示 AUC 范围为 0.647（ABC 方法）至 0.576（Pg 指数和 CEA）。 因此，该检测明显优于目前可用的测试，并且有可能用作胃癌 的风险评估工具和高风险人群的筛查工具。

此外，许多研究 探索 了使用其他 RNA 种类的可能性，例如 mRNA、长链非编码 RNA (lncRNA)和环状 RNA (circRNA)作为基于血液的胃癌 的生物标志物。 其中一些研究已经确定了显示出与上述 miRNA 面板相似的诊断性能的 RNA 生物标志物特征。 例如，剖析lncRNA 在匹配的术前和术后血浆、5 名 胃癌 患者的肿瘤和正常胃组织中的 lncRNA 的检测结果导致 5-lncRNA 指数的鉴定，随后在 321 名受试者中进行了测试，可用于区分 胃癌 和 健康 对照，激用于区分 胃癌 和癌前病变。 手术后 lncRNA 指数下降，表明血浆中这些 RNA 的主要来源是肿瘤组织，该指数适用于监测肿瘤动态。 综上所述， 这些研究提供了一个原理证明，即各种编码和非编码 RNA从癌组织释放到血液中 ，但是，需要进行大型前瞻性临床研究并与现有生物标志物进行比较，以评估其临床效用。

细胞外囊泡

“细胞外囊泡”是指从细胞自然释放到细胞外空间的各种膜结合囊泡，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。 细胞外囊泡 包含各种蛋白质、脂质、代谢物和各种编码和非编码 RNA，甚至 DNA 片段。 在包括 胃癌 在内的各种癌症患者的生物体液中发现 细胞外囊泡 水平增加，但仍不清楚这些 细胞外囊泡 是由癌细胞本身产生还是代表对疾病或治疗的全身反应。 此外，在患有各种非癌症疾病和生理应激状况的患者的血液中发现细胞外囊泡水平增加，因此细胞外囊泡 水平本身似乎不是癌症的高度特异性生物标志物。 细胞外囊泡 可能是液体活检中癌症衍生生物标志物的来源。 细胞外囊泡可能比循环肿瘤细胞、ctDNA 或基于 cfRNA 的液体活检有几个优势：(i) 细胞外囊泡比循环肿瘤细胞更丰富，因此可能比循环肿瘤细胞更好地反映肿瘤内异质性； (ii) 它们保护其货物免于降解，因此可能是比总血浆或血清更稳定的 cfDNA 和 RNA 来源，以及 (iii) 它们包含让人联想到其亲本细胞的分子特征，并且可能富含低丰度但高度特异性癌症生物标志物。

总结：

不推荐传统的肿瘤标志物（如 CEA、CA 19-9、CA 72-4 等）作为独立检测指标用于早期胃癌非侵入性检测。

研究最多的胃癌前病变标志物是胃蛋白酶原（Pg I、Pg I/II），然而，这些不能被视为癌症检测，但可用于识别监测风险增加的人群。 应该对癌前病变的检测进行额外的研究，以提高敏感性。

基于癌症特异性甲基化模式、循环蛋白和循环肿瘤 DNA 突变以及 多种组合miRNA 面板检测的方法已经证明了有希望的结果，使这些更接近实践，而基于循环检测的测试肿瘤细胞、细胞外囊泡和无细胞 RNA 需要更广泛的研究。

总之，对于胃癌或高风险癌前病变的完美检测方法的需求尚未得到满足，需要更多的研究来满足这一需求，目前早期胃癌的诊断还是需要靠胃镜检查来明确，其他方法并不可靠。

纯生信分析套路 综述|癌症中m6A与非编码RNA之间相互作用新见解

说起国自然研究新宠儿 “m6A甲基化修饰” ，想必大家都不陌生，m6A甲基化是包括mRNA和ncRNA（即非编码RNA，包括miRNA，rRNA，circRNA和lncRNA等）在内的所有RNA最普遍的表观遗传修饰。越来越多的证据表明，m6A甲基化修饰在各种生理和病理过程中都起着至关重要的作用。今天就向大家分享一篇发表在Molecular Cancer（IF：15.302）杂志上的关于m6A与ncRNA在癌症中相互作用的综述文章。

Part 1.初识m6A甲基化真面目

m6A，又称N6-甲基腺苷，指腺嘌呤的第6位氮原子（N）发生了甲基化修饰，通过甲基化酶复合物对甲基进行“书写”(Writer)、“擦除”(Eraser)或“阅读”(Reader)，进而对RNA发挥调控作用。

m6A甲基化的分子组成 —甲基化酶复合物

1)  甲基化转移酶(methyltransferase)：被称为“编码器”(Writer)，主要包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、METL16、RBM15 / 15B等；

2) 去甲基化酶(demethylase)：被称为“消码器”(Eraser)，主要包括FTO、ALKBH5等；

3)  m6A识别因子(recognition factors): 被称为“读码器”(Reader)，主要包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3、HNRNP、eIF3、IGF2BP1 / 2/3等。

图1.m6A甲基化修饰示意图：m6A甲基化是一个动态可逆的过程，由“Writer”、“Eraser”、“Reader”三者共同完成。

Part 2.m6A甲基化修饰miRNA

miRNA的失调参与多种生物学行为，如小鼠胎儿发育，免疫应答，炎症反应和致癌等，研究表明，m6A甲基化可以修饰参与多种miRNA的成熟，参与该过程的主要是甲基化转移酶METTL3和METTL14等：

① METTL3促进miR-25-3p成熟，miR-25-3p在胰腺导管腺癌（PDAC）中起关键作用；

② METTL3增强pri-miR-221 / 222与DGCR8的结合，而DGCR8参与了膀胱癌的增殖；

③ METTL3促进pri-miR-1246的成熟从而促进结直肠癌（CRC）的转移；

④ METTL3加速miR-143-3p的成熟，导致METTL3 / miR-143-3p / vasohibin-1轴的形成，有利于肺癌的转移；

⑤ METTL3通过修饰多个miRNA（miR-106b，miR-18a / b，miR-3607，miR-423，miR-30a，miR-320b/d /e）影响砷诱导的癌变；

⑥ METTL14促进pri-miR-126的成熟，从而可以抑制肝癌（HCC）的侵袭和转移。

图2. m6A甲基化修饰miRNA：调节胰腺导管腺癌，肺癌，肝癌，膀胱癌和结直肠癌等癌症的发生和转移

Part 3.m6A甲基化修饰lncRNA

lncRNA一般指长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，可在癌症中被m6A甲基化修饰，参与该过程的主要是甲基化转移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶ALKBH5，m6A识别因子YTHDF1、IGF2BP2等：

① MALAT1是首个被发现与肺癌相关的lncRNA，METTL3可以调节MALAT1-miR-1914-3p-YAP轴来诱导非小细胞肺癌的耐药和转移，还可以通过MALAT1/miR-145/FAK途径加重梗阻性肾病的肾纤维化；

② METTL3上调LINC00958，并使miR-3619-5p海绵化而促进HCC细胞的迁移和侵袭；

③ METTL3家族成员FAM225A充当海绵miR-590-3p / miR-1275的ceRNA和上调ITGB3来促进鼻咽癌（NPC）的发生和转移；

④ METTL3/14通过上调DKK1的lncRNA激活调节剂（LNCAROD）来增强头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的迁移；

⑤ METTL3介导lncRNA RP11通过Zeb1的上调增强CRC迁移和侵袭，而

METTL14增加lncRNA XIST的m6A水平，抑制CRC的增殖和转移；

⑥ ALKBH5通过维持FOXM1表达和细胞增殖程序来维持胶质母细胞瘤类干细胞（GSCs）的致瘤性，lncRNA FOXM1-AS可促进ALKBH5与FOXM1之间的相互作用；

⑦ ALKBH5通过减少lncRNA NEAT1的甲基化来促进胃癌（GC）的侵袭和转移。

⑧ YTHDF1与LINC00278相互作用可抑制食管鳞状细胞癌（ESCC）转移，而ALKBH5则促进ESCC转移；

⑨ IGF2BP2作为m6A读取器调节LncRNA DANCR，有利于胰腺癌的致癌性。

图3. m6A甲基化修饰lncRNA：参与多种癌症的肿瘤发生和转移，包括GSC，HNSCC，NPC，ESCC，肺癌，GC，HCC，胰腺癌和CRC

Part 4. m6A甲基化修饰circRNA

circRNA一般指环状RNA。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子（在活体中有时也有表达），也是RNA领域最新的研究热点。

circRNA在蛋白质翻译中起着至关重要的作用： METTL3和YTHDC1与环状RNA锌指蛋白609（circ-ZNF609）的代谢有关，并促进其生成，circ-ZNF609促进蛋白翻译和成肌细胞增殖；核糖体-circRNAs的“迷你基因”可以促进果蝇头部的蛋白翻译；

m6A甲基化会影响cricRNAs的蛋白质翻译： m6A基序在circRNA中富集，单个m6A位点被认为是启动circRNA翻译的触发器。m6A调控因子METTL3/14、FTO、YTHDF3和起始因子eIF4G2参与了m6A驱动的蛋白翻译。哺乳动物细胞可以识别circRNAs上的m6A修饰，通过抑制免疫基因激活和佐剂活性来抑制先天免疫。

circRNA的失调与多种癌症进展相关： circNSUN2的m6A甲基化修饰可促进细胞质输出并稳定HMGA2，从而促进结直肠肝转移；circPVRL3的m6A甲基化修饰可促进胃癌细胞的增殖和迁移。

表1：m6A甲基化修饰癌症中的ncRNA

Part 5. ncRNA调节癌症中的m6A甲基化

非编码RNA（ncRNA）具有影响涉及多个生物学过程m6A水平的能力。

miRNA调节癌症中的m 6 A甲基化：

① miR-33a通过靶向METTL3 mRNA抑制NSCLC细胞的增殖；

② miR-600抑制METTL3的表达并逆转了METTL3对NSCLC进展的积极作用；

③ miRNA let-7g通过靶向3'UTR下调METTL3表达，加速乳腺癌细胞的增殖；

④ miR-1266通过直接靶向FTO促进CRC的发生和发展；

⑤ miR-145通过靶向YTHDF2来抑制HCC的增殖；

⑥ miR-488是一种通过靶向eIF3a发挥作用的抑癌miRNA，还参与NSCLC细胞中eIF3a介导的顺铂耐药性；

⑦ miR-141通过形成miR-141 / IGF2BP2 / P13K / Akt轴来抑制胰腺癌的增殖。

lncRNAs调节癌症中的m 6 A甲基 化 ：

① lncRNA LINC00470与METTL3相互作用促进PTEN mRNA降解，从而促进GC进程；

② lncRNA miR503HG通过调节肝细胞癌中的HNRNPA2B1 /NF-κB途径来抑制肿瘤转移；

③ lncRNA LINC01234与HNRNPA2B1相互作用，促进NSCLC中的细胞增殖并抑制细胞凋亡；

④ lncRNA LIN28B-AS1与IGF2BP1相互作用，促进肺腺癌（LUAD）的增殖和转移；

⑤ lncRNA LINRIS可稳定IGF2BP2并促进CRC增殖；

⑥ lncRNA GAS5-AS1与ALKBH5相互作用调节GAS5的表达抑制子宫颈癌（CC）细胞的增殖，迁移和侵袭；

⑦ lncRNA GAS5可以抑制YAP介导的YTHDF3，从而抑制CRC的增殖；

⑧ lncRNA GATA3-AS增强KIAA1429和GATA3 pre-mRNA之间的相互作用，促进肝癌的进展。

表2：ncRNA调节癌症中的m6A甲基化

Part 6. m6A甲基化在癌症中的临床应用

m6A甲基化是癌症诊断和预后的新生物标记

① METTL3，YTHDC2和HNRNPC用于预测HNSCC患者的预后；

② METTL3/FTO上调或YTHDF2和METTL14下调可能预示GC、CRC和HCC的生存率较差；

③ METTL14低表达与肿瘤分化、临床分期、微血管浸润有关；

④ ALKBH5或FTO下调预示肺癌和HCC预后不佳；

⑤ IGF2BP2被认为是胰腺癌，食管胃交界腺癌和CRC的预后标记物。

m6A甲基化参与耐药性和癌症治疗

① METTL3稳定YAP和ARHGAP5，诱导NSCLC和胃癌顺铂耐药；

② HNRNPA2B1在他莫昔芬耐药乳腺癌中过表达，降低他莫昔芬的敏感性；

③ METTL3、METTL14、FTO、YTHDF2在急性髓性白血病（AML）中过表达，FTO抑制剂（FB23）及其衍生物（FB23-2）通过靶向FTO促进AML中的髓样分化和凋亡；

④ m6A甲基化参与胃癌的肿瘤微环境和TME浸润特征评估；

⑤ YTHDF2与炎症浸润，血管重建和远处转移相关，并预示肝癌的不良预后。

生信人往期也有很多有关m6A的好文章可学习：

m6A+免疫浸润

m6A+突变思路

m6A调节因子泛癌分析

结语

越来越多的研究关注于m6A甲基化如何改变ncRNA的稳定性、剪接和翻译，或ncRNA如何在癌症中调控m6A。m6A甲基化与ncRNA的相互作用可影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等不同的生命活动。就m6A甲基化的临床应用而言，可作为癌症诊断、预后和治疗的潜在靶点。然而，m6A甲基化与ncRNA之间的特异性结合位点还需要进一步研究。

无论是对于正在为写标书申基金发愁的老师们，还是正在为毕业课题发愁的研究生们来说，相信这篇综述都能够帮助你更好的理解m6A甲基化与ncRNA之间的相互作用，为你的课题添光加彩，感兴趣的小伙伴们赶快阅读起来吧！

2021-03-03 基于lncRNA的功能富集分析——lncSEA

        GO，KEGG，GSEA等久负盛名的功能富集分析方法对于解析各种基因的调控功能和互作网络起到非常重要的作用。但这些方法的一个很大的局限性就是只能针对蛋白质编码进行进行分析。因此，对于像miRNA，lncRNA和circRNA等非编码RNA的功能预测与分析时就需要采取迂回战略，即通过靶向关系（例如miRNA靶向调控蛋白编码基因），共表达关系（例如非编码RNA与蛋白质编码基因的共表达情况）和基因座位关系（例如lncRNA附近的蛋白编码基因，circRNA的宿主蛋白基因）等将非编码RNA集转换为对应的编码RNA集，再使用GO，KEGG，GSEA等工具进行功能富集分析。

        本研究则基于已有的lncRNA相关功能注释，开发了直接使用lncRNA进行功能富集的工具——lncSEA （ ）。

1. lncSEA整合18个lncRNA相关数据集，包括细胞标志物相关lncRNA，药物相关lncRNA，外泌体相关lncRNA，进化保守lncRNA，lncRNA亚细胞定位等；

2. 基于lncRNA一致的功能注释，lncSEA可以直接使用lncRNA进行功能富集分析；

3. lncSEA同时汇总了lncRNA转录调控相关数据，可以分析参与lncRNA转录调控的转录因子，超级增强子等反式和顺式调控因子。

Chen, J. et al. LncSEA: a platform for long non-coding RNA related sets and enrichment analysis. Nucleic Acids Res 49, D969-D980 (2021).

什么是NK细胞外泌体？

世界上有成千上万种不同的疾病，不过所有的疾病都可以归因于身体细胞功能出现了故障。 健康并不是一种偶然，而是一种选择 ，我们每个人都可以选择健康！

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是现代社会典型的“富贵病”之一。 Ⅱ型糖尿病(T2DM) 的病理相对I型糖尿病更为复杂，主要是胰岛β细胞功能障碍和不同程度的胰岛素抵抗，导致无法维持血糖稳态。典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即 “三多一少"症状 ，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害和功能障碍，最终可能发展为慢性并发症。

1、 II型糖尿病与胰岛素抵抗

现代社会物质极大丰富，各种美食不停刺激我们的味蕾，很少有小伙伴能抵挡美食的诱惑。然而随之而来的是 肥胖症 的发病率迅速升高，据统计，中国已成为肥胖人口最多的国家。而 肥胖则是Ⅱ型糖尿病的重要危险因素 。体内过多脂肪导致的游离脂肪酸会引起胰岛素抵抗，使脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞对胰岛素的敏感性降低，并导致胰岛素信号传导失调和葡萄糖、脂肪和蛋白质的代谢紊乱 ； 随之而来的高血糖症又促使胰腺不得不分泌更多胰岛素，导致高胰岛素血症。这些因素叠加起来，最终可能导致Ⅱ型糖尿病的发生。

2、 NK细胞与胰岛素抵抗的关系

胰岛 素抵 抗 是由肥胖所引发的严重的并发症，最终会导致Ⅱ型糖尿病。肥胖引起胰岛素抵抗的一个重要原因是起源于内脏脂肪组织（visceraladiposetissue,VAT）的慢性系统性炎症。VAT炎症与促进炎症巨噬细胞在脂肪组织的积累相关，但是诱发巨噬细胞积累的免疫信号仍然未知。

来自克罗地亚里耶卡大学的研究团队发现脂肪组织内的不同表型的自然杀伤细胞（naturalkiller,NK）在肥胖应激及胰岛素抵抗过程中发挥着重要作用。研究人员对两组实验小鼠分别给与普通饮食和高脂肪饮食，发现高脂肪的饮食组的脂肪组织里有NK和干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）的产生，这表明 NK在肥 胖引发的 脂肪应激和VAT炎症之间存在着关键的联系 。

研究结果表明：肥胖引起脂肪细胞中NK细胞激活受体1（NKcell-activatingreceptor1,NCR1）的配体上调；这刺激NK细胞增殖，刺激IFN-γ产生，进而引起促炎巨噬细胞的分化，产生胰岛素抵抗。NK细胞缺失，NCR1或者IFN-γ能阻止促炎巨噬细胞在VAT的积累，这会大大改善胰岛素敏感。

因此NK细胞是在响应肥胖引起的脂肪应激过程中巨噬细胞分化和胰岛素抵抗的 关键调控子 。此项研究提供了重要的理论依据，证明脂肪组织中的NK细胞及巨噬细胞，可作为治疗代谢综合症病人，及 降低Ⅱ型糖尿病进展风险的新靶点 。

3、 NK细胞外泌体：潜在新策略

自然杀伤(NK)细胞 被认为通过调节全身炎症与Ⅱ型糖尿病相关。然而，NK细胞调节胰岛素敏感性的机制仍然未知。

2021年11月30日，中国药科大学徐寒梅团队在SignalTransductionandTargetedTherapy（IF=18.19）在线发表题为“Naturalkillercell-derivedexosomalmiR-1249-3pattenuatesinsulinresistanceandinflammationinmousemodelsoftype2diabetes”的研究论文，该研究发现来自 瘦小鼠的NK衍生外泌体减轻了肥胖诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和炎症。此外，瘦NK衍生的外泌体可增强胰岛素敏感性并缓解脂肪细胞和肝细胞的炎症 。MiR-1249-3p在瘦NK衍生的外泌体中显著上调，可以通过外泌体从NK细胞转移到脂肪细胞和肝细胞。 NK衍生的外泌体miR-1249-3p显著诱导细胞胰岛素敏感性并缓解炎症 。

从机制上讲，外泌体miR-1249-3p直接靶向SKOR1以调节三元复合物SMAD6/MYD88/SMURF1的形成，其通过抑制TLR4/NF-κB信号通路介导葡萄糖稳态。该研究揭示了NK衍生的外泌体miR-1249-3p在缓解胰岛素抵抗中的新作用，并为Ⅱ型糖尿病提供了一系列潜在的治疗靶点。

Ⅱ型糖尿病是代谢性糖尿病的最常见形式，特征是 高血糖（也称为高血糖症）和胰岛素抵抗 。遵循高脂肪饮食的个体特别容易患肥胖症，这显然是人类胰岛素抵抗的最常见原因。胰岛素抵抗的症状包括脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞对胰岛素的敏感性降低，以及失调的胰岛素信号和葡萄糖、脂肪和蛋白质的代谢紊乱，最终导致Ⅱ型糖尿病的平行上升。Ⅱ型糖尿病患者总是伴随着亚临床全身性低度炎症反应和脂肪组织、肝脏、胰岛、下丘脑、心脏组织和其他组织的功能障碍，最终发展为慢性并发症。

先前的研究表明， 免疫系统调节全身的代谢器官 。各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞，在Ⅱ型糖尿病中起着至关重要的作用。肥胖诱导炎症，其特征是巨噬细胞浸润增加，并与巨噬细胞群从抗炎M2巨噬细胞转变为促炎M1巨噬细胞相关，在很大程度上导致肥胖引起的胰岛素抵抗。 NK细胞和巨噬细胞可以合作调节炎症 。此外，脂肪细胞上调肥胖中NK细胞激活受体(NCR1)的配体，这会触发NK细胞的增殖。事实上，NK细胞在肥胖诱导的炎症和胰岛素抵抗中起着关键作用。然而，NK细胞在肥胖引起的炎症中的作用和机制尚不清楚。 

外泌体是直径约30-150nm的囊泡状体 ，是细胞内体膜向内出芽形成的多囊泡，与细胞膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体由各种类型的细胞产生，并通过运输信息货物作为细胞间通讯的介质，例如蛋白质、脂质和RNA（miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA），在外泌体中稳定并转移。此外，外泌体可以由胰岛β细胞、干细胞和胰岛素敏感组织分泌，然后转移到代谢器官、免疫细胞和内皮细胞以维持葡萄糖稳态或通过免疫反应、氧化应激和血管生成加重胰岛素抵抗。然而，脾脏NK细胞衍生的外泌体在Ⅱ型糖尿病的发生和发展中的参与尚不清楚。

NK细胞通过控制炎症因子的释放在小鼠体内发挥抗抑郁样作用。 NK细胞衍生的外泌体miR-207减少促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α)的释放并减轻小鼠的抑郁样症状 。在这项研究中，揭示了 NK衍生的外泌体在缓解胰岛素抵抗中的新作用，并为Ⅱ型糖尿病提供了潜在的治疗靶点 。

circRNA研究应用专篇①：“sponge”与“biomarker”

circRNAs（Circular RNAs，环状RNA分子）是一类不具有5'末端帽子和3'末端 poly(A) 尾巴、并以共价键形成闭合环形结构的非编码RNA分子，在真核生物中广泛存在。近年来，circRNA 基金情况呈现增长趋势，在2020年基金额达到3000万+（数据摘自：Let Pub），研究热度可见。

circleRNA 的研究为何如此火热？它们在生物体的生长发育过程中、生理生化反应中凭借其独特的结构发挥着怎样的作用？别急，circleRNA 研究应用之上篇——sponge+biomarker，我为您倾情奉上，祝您科研一臂之力！

1、miRNA 分子海绵（sponge）

circRNA 含有大量的 miRNA 结合位点，具有 miRNA 海绵作用，进而间接调控 miRNA 下游靶基因的表达。

2、生物标志物（biomarker）

circRNA结构稳定、半衰期长，可在组织和发育阶段特异性表达，circRNA不仅存在于组织和细胞中，而且在体液中也有大量存在，可作为生物标志物。

作用机制：miRNA 海绵

背景：化疗耐药是三阴性乳腺癌（TNBC）临床治疗失败和预后不良的主要原因。 circRNA 在TNBC 化疗耐药性方面的研究尚为空白。

研究结论： CircWAC / miR-142 / WWP1形成竞争性内源RNA（ceRNA）网络，CircWAC通过靶向结合miR-142，上调WWP1并激活TNBC细胞中的PI3K / AKT信号传导活性进而诱导三阴性乳腺癌的化疗耐药性。

作用机制：miRNA 海绵

背景：CircRNA 的异常表达会导致人类疾病。circRNA 通过特定的 microRNA 来调节基因表达。本研究探讨 circMAP3K5（环状有丝分裂原激活的蛋白激酶5）是否可以充当竞争性结合内源性 microRNA-22-3p（miR-22-3p）海绵并调节新内膜增生。

研究思路：

研究结论：研究确定 circMAP3K5 为 TET2 介导的血管 SMC 分化的主要调控因子。靶向 circMAP3K5 / miR-22-3p / TET2 途径可能为与内膜增生相关的疾病（包括再动脉粥样硬化）提供潜在的治疗策略。

作用机制：biomarker

背景：目前，血液生物标记物已经被广泛用于癌症诊断，但低敏感性和特异性限制了它们在普通人群癌症筛查中的广泛应用。目前，研究者正致力于通过微创技术（即液体活检）获得新型、高精度的人体体液生物标志物。近年来，快速发展的高通量转录组分析技术已证实许多 circRNA 稳定存在于诸多体液中，包括血浆、血清、外泌体和尿液等。

研究思路：

研究结果：多种肿瘤研究结果证实，circRNA 可作为液体活检的重要分子标志物，作者还使用R中的 shinys 包开发了一个新的、直观的 web 界面，供用户探索和分析 circRNA。

作用机制：biomarker

研究背景：

胃癌是世界上最常见的癌症之一。由于缺乏特异性症状，80%以上的患者确诊时已是晚期，死亡率高，因此早期胃癌诊断势在必行。

研究思路

研究结论：

circPTPN22 可以作为一种有效的胃癌诊断和预后生物标志物，circPTPN22 表达下调，可通过影响EMT途径抑制胃癌细胞的增殖和转移，该研究成果提示，circPEPN22 可能通过 ceRNA 机制影响胃癌的进展。

参考文献：

1、 Wang L , Zhou Y , Jiang L , et al. CircWAC induces chemotherapeutic resistance in triple-negative breast cancer by targeting miR-142, upregulating WWP1 and activating the PI3K/AKT pathway[J]. Molecular Cancer, 2021, 20(1).

2、Zeng Z , Xia L , Fan S , et al. Circular RNA CircMAP3K5 Acts as a MicroRNA-22-3p Sponge to Promote Resolution of Intimal Hyperplasia via TET2-Mediated SMC Differentiation[J]. Circulation, 2021, 143(4).

3、Wang S , Zhang K , Tan S , et al. Circular RNAs in body fluids as cancer biomarkers: the new frontier of liquid biopsies[J]. Molecular Cancer, 2021, 20(1).

4、Ma S , Kong S , Gu X , et al. As a biomarker for gastric cancer, circPTPN22 regulates the progression of gastric cancer through the EMT pathway[J]. Cancer Cell International, 2021, 21(1).