脑脊液外泌体抽提（脑脊液 抽取）

本文目录一览：

• 1、脑脊液 | 生物标志物分类
• 2、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍
• 3、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？

脑脊液 | 生物标志物分类

参考资料：2018 Handbook of Clinical Neurology. The use of cerebrospinal fluid in biomarker studies.

脑脊液(CSF)中的多种成分，可用于多种目的的生物标志物研究，用于神经系统疾病通路中重要导联的诊断、预后、监测和识别。目前已广泛用于multiple sclerosis diagnosis和AD (tau蛋白的表达水平和磷酸化水平)的诊断。

由于需要通过腰椎穿刺获取脑脊液，属于侵入性取样，因此与其他样本（如血液）相比，脑脊液样本显得格外珍贵。

蛋白标志物主要有以下3种。

蛋白标志物的常用分析方法： ELISA（针对特定已知蛋白）和蛋白组学（蛋白质谱技术） 。CSF中的蛋白浓度比血浆中低大概200倍，因此需要高敏感度的方法来检测。

代谢物是细胞代谢的终产物或中间产物，参与能量转换、信号传导、表观修饰等过程。 CSF中最常用的代谢标志物是葡萄糖含量，其可作为感染、炎症、恶化等过程的标志物。

代谢组学方法：质谱分析法可分析了许多生物样品中不同的代谢物；核磁共振波谱法。

正常细胞在凋亡后会释放cfDNA,外周血中的cfDNA一般在150-200bp。CSF中的cfDNA主要用于 检测恶性肿瘤的体细胞突变或病原体感染 。肿瘤细胞释放的cfDNA的长度变化范围更广、可直接用于检测体细胞突变；CNS感染病原体后，来源于病原体的cfDNA可用于鉴定病原体。

检测方法：PCR（针对点突变）或全基因组测序

miRNA更加稳定，是内源性的非编码RNA，参与mRNA调控并介导多种细胞过程，通常长22-24核酸，并有发卡结构。

miRNA的异常表达模式已在多种神经退行性疾病中被报道 ，如multiple sclerosis, AD, trauma, CNS tumors.

检测方法：RT-PCR / qRT-PCR (针对特定miRNA); 二代测序（针对新的miRNA）

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在30–100 nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。

多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。其中 包含DNA、多种类型的RNA、脂质、蛋白和代谢分子等。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

胞外囊泡（1-2um)和外泌体(30-100nm)已被视为神经退行性疾病和恶性肿瘤生物标志物研究的热点。

方法：超速离心获取外泌体，，然后提取其中的mRNA或DNA。

作者大篇幅介绍了CSF成分的不稳定性，指出有多种因素会影响到分析结果。将其分为两类：患者相关的因素和环境（实验处理）因素。

不同对照组的纳入标准不同，由临床标准和实验室标准组成 （Table 1.4)。

QAlb：血浆和脑脊液之间的蛋白浓度梯度是由血-脑脊液屏障功能引起的，脑脊液球蛋白和与白蛋白的比例变化称作蛋白商。

现在常通过组学（蛋白组学等）方法比较疾病早期的CSF和晚期的组织，来鉴定新的标志物。如常用的蛋白质谱法，但是目前能用于临床的标志物仍然很少，这主要归因于两点：一是目前的蛋白质谱的敏感度有限；二是CSF中蛋白含量很低。

另一个方法是利用多重抗体或aptamer-based芯片来提高抗体敏感性。这种芯片可以检测超过1000种蛋白。或者针对组织进行组学测定，找到差异表达蛋白，然后在CSF中检测这些蛋白；或根据溶解度和分泌亚型对CSF是否存在某些蛋白先进行预判。

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍

外泌体的实验的基础，很多童靴认为这是最简单的。如果你真的这么认为，那么就大错特错了。收集样本有不同的要求，一个比一个重要。那该如何去选择我们的实验样本？取样的时候又该注意些什么？分离好后的外泌体又如何保存呢？

一、外泌体样本的选择和注意事项

实验样本不同在收集的时候需要注意的点不同。你研究的是哪种样本，需要特别注意哪些方面呢？看以下阐述：

1、细胞上清

选用细胞培养上清作为分离外泌体的实验材料不会像血样等存在样本量限制的问题，而且操作简单，直接离心即可。但在细胞培养过程中需注意污染、培养时间、细胞死亡率及FBS的问题。和所有的细胞实验一样，培养过程中不允许有污染，但有些培养细胞本身带有病毒基因组，在培养过程中会释放出病毒颗粒，这就要衡量病毒颗粒是否会影响后续实验。

一般培养24-48h后细胞即可分离外泌体，在特殊情况下，如在培养基中添加特殊的化学物质，培养15-60min即可收集。因细胞死亡会分泌小体，所以在研究外泌体时细胞的死亡率一定要控制 5% 之内。未经处理的FBS中含有大量的外源外泌体，所以细胞培养一定要用经过处理不含外泌体的FBS。

2、唾液

唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同，所以同血样一样需定点定时。唾液主要由舌下腺，颌下腺及腮腺3个腺体分泌，所以不同位置的唾液成分不同，在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液。不同时间段的唾液成分也会不一样，所以也需定时取。其他如吸烟进食都是禁止的，一般建议采样1h之内不能有进食行为，包括饮料，且不要剧烈运动，在平息状态下取样。最后一点，不能刷牙。

3、血液

在第一次外泌体课程的时候，就有许多同学问到关于血清和血浆选择的问题，那到底应该选哪个呢?血浆=血液-血细胞 血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子

分不清楚两者的弄清血清的来源就能牢牢记住啦。血清是血液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。

受限于样本，血样一般取2ml。那取血样的时候有什么注意的地方呢？在外泌体的血样研究中，经常被忽略的一个问题就是针头的大小。在抽血过程中，血液流经针头的时候会产生剪切力，若针头太细，剪切力较大，会使细胞破碎或刺激血小板分泌外泌体，从而影响后续的实验。有些文献报道21号针头的大小比较合适作为外泌体研究的血样收集。其他诸如采血的位置，人的生理周期，饮食周期及时间周期（24h）等都会影响样品中的外泌体。所以取样的时候尽量定点定时。最后还需注意，尽量在采血30min内处理样本，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。

4、鼻涕

研究鼻涕有一个特殊的价值，其可以探索治疗性外泌体。啥是治疗性外泌体？在脑部的疾病治疗中，药物可以外泌体的方式注射到鼻腔，这样药物就可以避开血脑屏障。鼻涕的收集与许多环境因素相关，如年龄、季节、性别 、城市、过敏史及职业风险。鼻涕的收集方法没有统一标准，只需保证所有样本取样方法一致即可。

5、尿液

在尿液的取样中，除性别、年龄、进食等影响外，还有一个特殊的点即是尿液的新鲜程度，这个新鲜度指的是尿液在膀胱中存在的时间。

6、乳汁

乳汁中存在的外泌体、抗体等会影响新生儿的发育，具有较大的研究价值。泌乳的阶段、 胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂养、母亲的健康状态、精神状态等都会影响外泌体的分泌。需要注意的是乳汁中含有大量的脂蛋白，会对后面分离外泌体产生影响。

7、脑脊液

脑脊液研究面临的困难主要在样本的获取及样本中外泌体丰度少，有木有一种雪上加霜的感觉。那这个问题如何解决？国外可购买商业正常样本或者使用其他疾病样本作为对照。

二、外泌体的保存

对于外泌体的保存，和其他分子样品一样，提取的外泌体低温保存即可，短时间（一周之内）可放4度，长时间放-20或-80。也有人认为放4度更好，怕低温冻融会影响外泌体的完整性，但目前还没有一个定论，而且大部分文献认为没有影响。那到底放几度呢？有一招，分装放-20或-80，是不是妥妥的。

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？

外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。

由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。