细胞免疫荧光染色（细胞免疫荧光染色不均匀）

本文目录一览：

• 1、关于细胞免疫荧光染色的问题
• 2、什么是免疫荧光染色诊断
• 3、细胞免疫荧光，求助

关于细胞免疫荧光染色的问题

(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;

(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;

(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。

做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?

参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。

(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。

(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。

(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。

什么是免疫荧光染色诊断

免疫荧光染色诊断:

用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体。 用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

原理：

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

扩展资料：

免疫荧光检查可分直接法、间接法、夹心法和补体法。

1、 直接法的操作过程：

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

2、间接法的操作过程：

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。

参考资料：百度百科-免疫荧光

百度百科-免疫荧光检查

细胞免疫荧光，求助

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。实验步骤如下：

1、已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

2、 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。

3、吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。

4、0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

5、与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。

6、 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。

7、加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。

次日：

8、取出细胞复温至室温约1h。

9、冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

10、配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(HL) TRITC，用PBS或FBS配制。浓度1:200

11、加入二抗，室温孵育1小时(避光)。

12、 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

13、DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。

14、 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

15、加入防荧光淬灭封片剂，避光。

16、上机confocol

建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。