外泌体提蛋白95度3分钟（外泌体提蛋白95度3分钟正常吗）

本文目录一览：

• 1、请问有没有人知道植物胞间隙蛋白质的提取方法
• 2、求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol
• 3、c2c12细胞nac处理后 怎样提蛋白
• 4、要想从小麦叶片中提取蛋白质怎样进行预处理
• 5、外泌体提取策略

请问有没有人知道植物胞间隙蛋白质的提取方法

一、植物组织蛋白质提取方法

1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清液，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml

2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

二、植物组织蛋白质提取方法

氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、组织：肠黏膜

目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

应用TRIPURE提取蛋白质步骤：

含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

倒转混匀，置室温10min

离心：12000 g，10min，4度，弃上清

加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）

振荡，置室温20min

离心： 7500g，5 min，4度，弃上清

重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次

沉淀中加入100％乙醇 2ml

充分振荡混匀，置室温20 min

离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

离心：10000g，10min，4度

取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）

存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根

1、200毫克样品置于冰上磨碎

2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清

3、重复离心5min

lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

五、蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存

六、植物根中蛋白质的抽取

(1) sample, 液氮研磨

(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube

(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul

(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

(5) 取上层液，蛋白质就在里面

求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol

我个人经验，也以六孔板为例：

1、移除旧培养液

2、每孔加PBS1ml，漂洗1到2次

3、每孔加蛋白裂解液100ul（蛋白裂解液不易加多，多了会稀释蛋白浓度）

4、然后用细胞刮棒来回刮除细胞，用枪头吸出液体至干净的EP管（操作最好在冰上，尽量吸干净）

5、短暂振荡一下，置冰静置15到30分钟

6、离心：12000转，20min。离心结束后你会看到管底有沉淀

7、将上清液移至新的EP管，注意不要碰到沉淀，取10ul留作后来蛋白定量，剩下的记下转移量

8、我们实验室用5X上样缓冲液按1:4的体积加入，比如你上面的转移量是80微升，那么就加入5X上样缓冲液20微升。

9、短暂振荡，离心

10、煮蛋白，就是沸水5分钟

11、最后-80度保存就可以了

我自己就这样，呵呵，其实很简单

c2c12细胞nac处理后 怎样提蛋白

c2c12细胞nac处理后 怎样提蛋白

原理：

1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。

2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。

3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

方法步骤：

1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。 5 min

2．溶解DNA：

3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢

4．过滤：取黏稠物

5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3 min

6．过滤：取滤液。

7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5 min

8．DNA的鉴定：沸水浴5min

大学：

DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

2.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

3.DNA提取的几种方法

(1).浓盐法

A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.

B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. （2）.阴离子去污剂法; 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.

要想从小麦叶片中提取蛋白质怎样进行预处理

植物叶蛋白的提取主要有盐析法、有机溶剂沉淀法、加热法(含逐步和快速加热)、 离心分离法、结晶和重结晶法等。依据今后的开发方向(以饲料为基础，以食品、饮品为开发方向)及简便易行和使用的原则，主要采用盐析法、加热法和有机溶剂法分离提取叶蛋白(冷提和热提)。不同的提取方法，对样品的处理方式、程度和要求不同，结果也有差异。

(一)(NH4)2SO4 沉淀法提取叶蛋白

取0.3g 植物叶蛋白，用液氮充分研磨转入离心管中，加入3mL 提取缓冲液，摇匀并放在4℃条件下提取1h，充分溶解蛋白后，4℃10000r/min 离心20min，弃沉淀，上清液中加入(NH4)2SO4 ，混匀1h，按1：2(v/v)加入-20℃预冷的80%丙酮，混匀后4℃12000r/min 离心10min，沉淀在-20℃冰箱中放置20min，使丙酮完全挥发后加适量上样缓冲液，待沉淀充分溶解后，4℃12000r/min 离心5min，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。

(二)改良丙酮沉淀法提取叶蛋白

取0.3g 左右的植物叶片，用液氮研磨，色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP，并将充分研磨过的样品转入离心管中，加入4mL 的提取缓冲液，摇匀并放在4℃条件下提取1h，充分溶解蛋白。放置后的样品充分摇匀，4℃10000r/min 离心30min，弃沉淀，上清液中加入2.5～3倍体积的村-20℃条件下过夜，让蛋白充分沉淀。之后，4℃10000r/min 离心30min，其上清，沉淀置于-20℃下，使丙酮完全挥发，如有必要加入上样缓冲液溶解沉淀。缓冲液用量300ul，沉淀充分溶解后，转移至1.5mL 离心管中，4℃12000r/min 离心15min ，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。

该方法提取的蛋白质，提取效率高，杂质干扰少，电泳结果蛋白条带清晰，数量多。

(三)植物叶片总蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法 ①在液氮中研磨适量的叶片；

②悬浮于含10%的三氯醋酸和含0.07%β-巯基乙醇(可用DTT 代替)的丙酮溶液在-20℃条件下冰浴；

③让蛋白质沉淀过夜后离心(4℃ 10000r/min 离心30~60min)，弃上清； ④重悬沉淀浮于含0.07%β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液中； ⑤离心(同上)后真空干燥沉淀； ⑥用上样缓冲液溶解沉淀，离心；

⑦Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管中保存在-78℃备用。 (四)分步提取可溶性叶蛋白

(1)蛋白质浸出 ①水溶性蛋白质浸出：用0.05molpH7.0的磷酸缓冲液(或蒸馏水)将样品制成匀浆液，然后离心15min(4000r/min)，收集上清液即蛋白质浸出液，再将沉淀物按上述操作重复两次。②盐溶性蛋白质浸出用10％NaCl 将前者剩余沉淀物分离提取两次，收集蛋白质浸出液。

(2)蛋白质沉淀用0.1mol 醋酸将蛋白质浸出液pH 值调至蛋白质等电点(pH4.5左右)，即8体积蛋白质浸出液加入1体积0.1mol 醋酸，混匀，离心15min(3000r/min)，弃去上清液，沉淀物即为可溶性叶蛋白。

(3)蛋白质收集于沉淀物中加入95％乙醇，混匀，用定量滤纸过滤或抽滤，待风干后收集。

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。