为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性（为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性的原因是）

本文目录一览：

• 1、如何做好免疫荧光
• 2、关于细胞免疫荧光染色的问题
• 3、酶免疫细胞如何进行化学染色？

如何做好免疫荧光

免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。

1、细胞固定和通透

为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。

2、抗体特异性

免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。

3、合适的抗体稀释比例

通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

4、优化缓冲液和封闭剂

尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。

5、选择正确的二抗

如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。

6、使用合适的细胞密度

选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。

7、多重染色

对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。

8、降低背景

高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。

9、封片

作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。

10、数据分析

观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。

关于细胞免疫荧光染色的问题

(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;

(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;

(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。

做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?

参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。

(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。

(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。

(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。

酶免疫细胞如何进行化学染色？

免疫细胞化学染色是将血液、骨髓液、浆膜腔积液等等各种体液组织制成的涂片和骨髓等组织的切片经各种单克隆抗体的标定和常用的过氧化物酶或碱性磷酸酶显色后对白血病细胞直接镜检，以确定细胞类型。

免疫组织化学染色方法繁多，可根据标记物的不同分为：免疫酶细胞化学染色、免疫荧光细胞化学染色、免疫金银染色技术以及亲合免疫组织化学染色技术等。目前血液系统疾病检查常用免疫细胞化学染色方法有三种：过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）法和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC-AP）法。PAP法抗原、抗体反应及酶标原理与APAAP法完全相同，都属于免疫组织化学反应，只是所标记的酶不同。PAP法酶化学反应原理与ABC-AP法完全相同，但ABC-AP法为亲合免疫组织化学反应。在染色步骤及方法上PAP法和ABC-AP法完全相同。

免疫细胞化学能够识别抗原蛋白质一级结构中氨基酸的差别，从而对细胞结构、功能及细胞代谢等进行综合分析，确定细胞的类型、来源及细胞的分化阶段。应用骨髓切片免疫组织化学技术可以对骨髓细胞进行原位观察，通过对细胞特异性抗原的定性、定位和定量分析，了解骨髓组织和细胞的结构和变化，这对血液系统疾病尤其是血液系统肿瘤的诊断、鉴别诊断，以及血液肿瘤的分类、分型和预后的判断提供了有利的研究手段。