稳定细胞株筛选（稳定细胞株筛选系统）

本文目录一览：

• 1、如何建耐药细胞株？
• 2、稳转株加压筛选的目的
• 3、原代细胞构建稳定细胞株需要什么条件？
• 4、如何构建稳定细胞株？
• 5、原代的细胞到底能不能够构建稳定的细胞株呢？

如何建耐药细胞株？

一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。

脂质体转染：在转染24小时后，消化细胞并计数。将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。筛选时间和浓度视细胞而定。一般G418一个星期作用，嘌呤霉素2-3天。

脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。

病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。

病毒转染得到稳定细胞株的效率高，只是步骤繁琐。

现在很多家公司提供构建稳定细胞株的技术服务，如杭州的波因，南京的凯基等，可以提供各种载体的构建及细胞株的构建整套技术服务。

稳转株加压筛选的目的

稳转株加压筛选的目的是基因DNA整合到细胞基因组上，使细胞长期稳定表达该基因。稳转株即稳定表达的细胞株，指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。

原代细胞构建稳定细胞株需要什么条件？

转染 24 小时后，细胞被消化并计数。将细胞植入 96 孔板中，以确保每孔 2－3 个细胞，从而获得单克隆。细胞粘附在壁上后，添加抗生素进行筛选。筛选时间和浓度取决于细胞。通常，G418 生效一周，嘌呤 2－3 天。脂质体单克隆的筛选时间长且效率低，仅约 1％。病毒转染， 首先包装细胞，通常是 293 个细胞，以包装病毒，然后用病毒转染靶细胞。

包装病毒取决于不同类型的病毒，一般需要 3－5 天，应测量包装病毒的滴度，并根据滴度确定转染靶细胞的病毒量，在转染靶细胞后 1－2 天，通过抗生素筛选稳定的细胞系。转染获得稳定细胞系的效率高，但步骤繁琐。目前，许多公司提供构建稳定细胞系的技术服务，如杭州那边的波因，南京的凯基那样，他们可以为各种载体和细胞系的构建提供一整套技术服务。

它是脂质体转染后克隆和筛选的稳定细胞系，另一种是利用逆转录病毒和慢病毒转染来筛选稳定的细胞系，通过蛋白酶或其他方法从人体组织，如人体组织里面的小鼠组织，大鼠组织，兔组织等， 和体外模拟体培养获得的细胞，他们被称为原代细胞，一般认为第一代培养的原代细胞和传给第 10 代的细胞统称为原代细胞培养。

使其原代细胞在人工条件下存活，生长，繁殖和传递，研究细胞生命过程，细胞癌变，细胞工程等问题。通过选择方法或克隆形成方法从原代培养细胞中获得的具有特殊性质的细胞或标记物称为细胞系，一般认为，细胞系是通过单细胞隔离培养或筛选，由单细胞增殖形成的细胞群。

如何构建稳定细胞株？

构建方法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。

细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。

细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。

扩展资料：

一般流程

1、筛选浓度测定：以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；

2、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；

3、细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6 ）；

4、利用质粒上含有的抗性选择进行筛选；

5、鉴定筛选结果。

参考资料：百度百科-细胞株

百度百科-稳定细胞系

原代的细胞到底能不能够构建稳定的细胞株呢？

原代细胞要建立稳定的细胞系，必须满足一定的条件。

转染24小时后，细胞消化计数。将细胞植入96孔板，保证每孔2-3个细胞。细胞贴壁后，加入抗生素进行筛选。筛选时间和浓度取决于细胞。一般来说，G418起效一周，嘌呤2-3天。脂质体单克隆抗体筛选时间长，效率仅为1%左右。病毒转染，首先包装细胞，通常是293个细胞，包装病毒，然后用病毒转染靶细胞。

包装病毒取决于不同类型的病毒，一般需要3-5天。测定包装病毒的滴度，根据滴度确定病毒转染靶细胞的量。转染后1-2天用抗生素筛选稳定的细胞株。转染效率高，但步骤复杂。目前，许多公司为稳定细胞系的构建提供技术服务，如杭州博恩、南京凯基等。它们可以为各种载体和细胞系的构建提供一整套技术服务。

脂质体转染后克隆筛选出稳定的细胞株。二是通过逆转录病毒和慢病毒转染筛选稳定的细胞株。它可以通过蛋白酶或其他方法从人体组织中获得，如小鼠组织、大鼠组织、兔组织等，称为原代细胞。一般认为，在第一代培养的原代细胞和转移到第十代的细胞统称为原代细胞培养。

使原代细胞在人工条件下存活、生长、增殖和转移，研究细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题。通过选择或克隆形成方法从原代培养细胞中获得具有特殊性质的细胞或标记物称为细胞系。一般认为细胞系是单个细胞通过分离培养或筛选而形成的细胞群。

总而言之，实验环境稳定，温度适宜，原代细胞健康。在满足这些条件后，再等待一段时间，即可进行栽培，这样才可以构建稳定的细胞株。