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超滤外泌体可以直接上6000g（超滤加活性炭可以直接喝吗）

2023-01-24 03:56:31 作者：max

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本文目录一览：

1、梯度离心法提取外泌体可以用190000g吗?
2、临床检验技师考点：机体水、电解质的平衡及紊乱
3、羊胎盘提取技术发明专利在中国分布给谁了？
4、常用的工业酶有哪些?
5、蛋白的表达与纯化
6、净水器十大名牌排行榜？

梯度离心法提取外泌体可以用190000g吗?

可以。梯度离心法提取外泌体可以用190000g，梯度的本意是一个向量（矢量），表示某一函数在该点处的方向导数沿着该方向取得最大值，即函数在该点处沿着该方向（此梯度的方向）变化最快，变化率最大（为该梯度的模）。

超滤外泌体可以直接上6000g（超滤加活性炭可以直接喝吗）

临床检验技师考点：机体水、电解质的平衡及紊乱

导语：人体内存在的液体称为体液。体液中含有多种无机物和有机物。无机物与部分以离子形式存在的有机物统称为电解质。葡萄糖、尿素等不能解离的物质称为非电解质。

体液以细胞膜为界分为细胞内液和细胞外液。

正常情况下，体液之间的水与电解质处于动态平衡，这种平衡状态易受体内外因素影响而被破坏，导致代谢紊乱，即水、电解质和酸碱平衡紊乱。

第一节　机体水、电解质的平衡及紊乱

一、体液中水、电解质分布及平衡

(一)水的分布及平衡

人体内含水量与年龄、性别有关，还与组织结构有关。

1.水的来源和去路：

水的来源：

饮水约1200ml、食物中含水约1000ml、代谢内生水约300ml，共约2500ml。

水的去路：

肾脏排尿1500ml、自肺呼出400ml、皮肤蒸发500ml、粪便排出100ml，共约2500ml

正常情况摄入量与排出量持平。

2.影响体液动态平衡的因素

(1)影响水在血管内外转移的因素主要通过血管壁

血浆胶体渗透压(主要)、毛细血管通透性、毛细血管静水压

(2)影响水在细胞内外转移的因素主要通过细胞膜

晶体渗透压

水从低渗透压的一侧流向高渗透压一侧。

正常情况下，细胞内外渗透压相等

3.水代谢平衡的调节：

水的调节中枢在下丘脑，通过神经体液调节

(1)口渴思饮

产生口渴的原因：血浆晶体渗透压升高、血管紧张素Ⅱ增多、生活习惯等。

(2)抗利尿激素：

抗利尿激素的作用是作用于远端肾小管的，促进水的重吸收,减少尿量。

血浆晶体渗透压升高、血容量下降、剧烈运动和疼痛等可使抗利尿激素分泌增多。

(3)心房肽、肾素-醛固酮系统亦有调节水的功能。

(二)电解质分布及平衡

1.电解质的含量和分布：

有机电解质：蛋白质和有机酸

无机电解质：主要是无机盐，

无机盐中所含的金属元素是Na+、K+、Ca2+、Mg2+，以及微量的铁、铜、锌、锰、钼等。

(1)钠、氯

是细胞外液中主要阴阳离子，每公斤体重约含钠1克。

钠离子是细胞外液含量最高的阳离子，对保持细胞外液容量、调节酸碱平衡、维持正常渗透压和细胞生理功能有重要意义。

来源：机体通过膳食及食盐形式摄入氯和钠，

排泄：Na+、Cl-主要从肾排出，肾排钠量与食入量保持平衡。

肾对保持体内钠含量有很重要的作用，“多吃多排，少吃少排，不吃不排”

钠代谢的调节：钠代谢的调节主要通过肾脏，调控钠排出的因素有：

①球-管平衡：肾小管重吸收的钠与肾小球滤过的钠成比例。

②肾素-血管紧张素-醛固酮系统：此系统是调控水盐代谢的重要因素

③其他激素：抗利尿激素、糖皮质激素、甲状腺素、甲状旁腺素和心钠素等。

(2)钾

是细胞内液的主要阳离子之一，健康成年人，每公斤体重含钾量为2克

分布：98%分布在细胞内液，2%在细胞外液。

来源：钾，人体钾的来源全靠从食物中获得，在动植物食品中含量丰富。

排泄：主要通过肾脏排出，特点是“多入多出，少入少出，不入也出”，所以禁食的病人应注意补钾。

各部分体液中的电解质含量不尽相同(见表3-6-1)。

(3)体液电解质分布特点

①血浆和细胞内液离子分布不同

血浆：

阳离子：Na+、Ca2+、Mg2+、 K+，其中以Na+含量最高，约占阳离子总量的90%以上，

阴离子：Cl-和HCO3-为主

细胞内液：

阳离子：K+、Mg2+和Na+，K+最多

阴离子：磷酸盐和蛋白质为主，

细胞内外液中钠和钾的浓度的差别主要依赖于细胞膜上的特殊结构即Na+-K+ATP酶(钠泵)的主动转运功能

钠泵将细胞内液的钠离子运转到细胞外液，将钾离子转移到细胞内液。

该过程耗能

消耗一个分子的ATP，可将3个钠离子从细胞内泵到细胞外，将2个钾离子和1氢离子由细胞外泵到细胞内。

电解质的作用：维持细胞内外液的渗透压、体液的分布和转移、参与酸碱平衡及神经肌肉兴奋性的维持。

细胞间液是血浆的超滤液，其电解质成分和浓度与血浆极为相似。

②体液中阴离子总数与阳离子总数相等，并保持电中性

一般阴离子随阳离子总量的改变升高或降低，以适应阳离子的改变。

血浆中Cl-、HCO3-总和与阳离子Na+浓度之间保持有一定比例关系，

即：Na+=HCO3-+Cl-+12(10)mmol/L。

③各体液渗透压相同，

摩尔渗量为294～296mOsm/L;

理论渗透压为756～760kPa。

2.电解质与血浆晶体渗透压：

根据血浆钾、钠、葡萄糖、尿素的浓度可计算出：

血浆晶体渗透压=2(Na+ + K+)+葡萄糖+尿素。

二、水、电解质平衡紊乱

(一)水平衡紊乱

水平衡紊乱可表现为总体水过少或过多或总体水变化不大，但水分布有明显差异

水平衡紊乱往往伴随有体液中电解质的改变及渗透压的变化。

1.脱水：

人体体液丢失造成细胞外液的减少，称为脱水。

脱水因血浆钠浓度变化与否，又可将脱水分为高渗性、等渗性和低渗性脱水。

(1)高渗性脱水：

失水失电解质

原因：多见于饮水不足，如高温作业大量出汗，或非显性失水持续进行从而使水排出量增多。

特点

①体液电解质浓度增加，渗透压升高;

血浆Na+浓度大于150 mmol/L或Cl—与HCO3-浓度之和大于140mmol/L;

②细胞外液量减少;

③细胞内水向细胞外液转移，造成细胞内液明显减少。

临床症状：口渴、体温上升、尿量减少、出现各种神经症状，体重明显下降等。

(2)等渗性脱水：

失水=失盐

原因：常见于呕吐和腹泻等丧失消化液情况，

特点：

①体液电解质浓度改变不大，渗透压保持正常

血浆Na+浓度为130～150mmol/L或Cl—与HCO3-浓度之和为120～140mmol/L，

②细胞外液量减少，细胞内液量正常。

③胞外液量减少可导致血容量不足，血压下降、外周血液循环障碍等。

(3)低渗性脱水：

失盐失水

原因：丢失体液时，只补充水而不补充电解质造成，

如胃肠道消化液的丧失(腹泻、呕吐等)以及大量出汗情况下，仅补充水分而未补充丧失的电解质，

特点：

①血浆Na十浓度小于130mmol/L或Cl—与HCO3-浓度之和小于120mmol/L。

细胞外液的渗透压低于正常

②细胞外液量减少，细胞内液量增多，

③重稍有减轻。

2.水过多：

当机体摄入水过多或排出量减少，使体液增多、体重增加、血容量增多以及组织器官水肿。根据体液的晶体渗透压分为三种类型：

高渗性(盐中毒)、等渗性(水肿)及低渗性(水中毒)水过多。

临床上水肿较为常见。

水肿时细胞外液量(主要是组织液)增多，而渗透压仍在正常范围。

一般当增加的体液量超过体重的10%以上时，可出现水肿临床表现。

水肿常见的原因有血浆蛋白浓度降低，或充血性心力衰竭，或水和电解质排泄障碍等。

(二)钠平衡紊乱

水与钠的正常代谢及平衡是维持人体内环境稳定的重要因素。

细胞外液钠浓度的改变可由水、钠任一含量的变化而引起，

钠平衡紊乱常伴有水平衡紊乱。

1. 低钠血症：

血浆钠浓度小于130mmol/L称为低钠血症

血浆钠浓度是血浆渗透浓度(Posm)的主要决定因素，低钠血症又称低钠性低渗综合征。

Posm降低导致水向细胞内转移，使细胞内水量过多，这是低钠血症产生症状和威胁生命的主要原因。

血浆钠浓度并不能说明钠在体内的总量。

(1)原因：

摄入少(少见)、丢失多、水绝对或相对增多

(2)类型：可分为肾性和非肾性原因两大类。

肾性原因：

肾功能损害：可因渗透性利尿、肾上腺功能低下以及急、慢性肾功能衰竭等引起低钠血症。

非肾性原因：

可见于呕吐、腹泻、肠瘘、大量出汗和烧伤等疾病过程，除丢失钠外，还伴有不同比例的水的丢失。

低钠血症使细胞外液渗透压下降，水分向细胞内转移，进而出现细胞水肿，严重者有可能出现脑水肿和消化道紊乱。

假性低钠血症：由于血浆中一些不溶性物质和可溶性物质的增多。使单位体积的水含量减少，血钠浓度降低(钠只溶解在水中)，引起低钠血症，前者见于高脂蛋白血症(血脂10g/L高球蛋白血症(总蛋白100g/L如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、干燥综合征);后者见于静脉注射高张葡萄糖或静脉滴注甘露醇以后。

2.高钠血症：

主要见于水的摄入减少(如下丘脑损害引起的原发性高钠血症)、

排水过多(尿崩症)、

钠的潴留(原发性醛固酮增多症、Cushing综合征)。

(三)钾平衡紊乱

1.钾代谢：

钾是维持细胞新陈代谢、调节体液渗透压、维持酸碱平衡和保持细胞应激功能的重要电解质之一。

(1)来源去路：

来源：食物

每日摄入量50～75 mmol，一般膳食每日可供钾50～100mmol;足够维持生理上的`需要。

90%的钾由肠道吸收

(2)钾代谢的调节：

体内钾的主要排出途径是经肾以尿钾形式排出。肾排钾对维持钾的平衡起主要作用。

①影响肾脏排钾的主要因素：醛固酮，其次为糖皮质激素，

体液酸碱平衡的改变也影响肾脏对钾的排泄，酸中毒时，尿钾增多;碱中毒时，尿钾减少。

②影响钾在细胞内外转移的因素

生理性因素：Na+-K+ATP酶、儿茶酚胺、胰岛素、血糖浓度、剧烈运动等;

病理性因素：血pH、高渗状态、组织破坏、生长过快等。

钾的浓度与细胞外液HCO3-的浓度直接有关.

2. 钾平衡紊乱：

钾总量是指体内钾的总含量，由于钾主要分布在细胞内(约占总量的98%)，因此血K+浓度并不能准确地反映体内总钾量。

血K+浓度是指血清K+含量，

血浆钾浓度要比血清钾浓度低约0.5mmol/L左右，因为血液凝固成血块时，血小板及其他血细胞会释放少量钾入血清之故，临床以测血清钾为准。

影响血钾浓度的因素：

钾在细胞内外的移动

血浆的浓缩与稀释

钾总量过多或过少

当细胞内钾向细胞外大量释放或血浆明显浓缩,钾总量即使正常甚至缺钾也可能出现高血钾

体液酸碱平衡紊乱，必定会影响到钾在细胞内、外液的分布以及肾排钾量的变化。

(1)低钾血症：

血清钾低于3.5mmol/L以下，称为低钾血症。

原因：

①钾摄入不足;

长期进食不足(如慢性消耗性疾病)或者禁食者(如术后较长时间禁食)，

由于钾来源不足，而肾仍然排钾，很易造成低钾血症。

②钾丢失或排出增多：

严重腹泻、呕吐、胃肠减压和肠瘘者，

肾上腺皮质激素有促进钾排泄及钠储留作用，当长期应用肾上腺皮质激素时，均能引起低血钾;心力衰竭，肝硬化患者，在长期使用利尿剂时，因大量排尿增加钾的丢失;

③细胞外钾进入细胞内：

如静脉输入过多葡萄糖，尤其是加用胰岛素时，促进葡萄糖的利用，进而合成糖原，都有K+进入细胞内，很易造成低血钾#

代谢性碱中毒或输入过多碱性药物，形成急性碱血症，H+从细胞内进入细胞外，细胞外K+进入细胞内，造成低血钾症。

血浆稀释也可形成低钾血症。

(2)高钾血症：

血清钾高于5.5mmol/L，以上，称为高血钾症。

原因：

①钾输入过多，

钾溶液输入速度过快或量过大，特别是有肾功能不全、尿量减少，又输人钾溶液时易于引起高血钾。

②钾排泄障碍：

各种原因引起的少尿或无尿如急性肾功能衰竭;

③细胞内的钾向细胞外转移，

如大面积烧伤，组织细胞大量破坏，细胞内钾大量释放入血;

代谢性酸中毒，血浆氢离子往细胞内转移，细胞内钾向细胞外转移，与此同时，肾小管上皮细胞泌H+增加，泌K+减少，使钾贮留于体内。

三、钾、钠、氯测定及方法学评价

(一)样品的采集和处理

血清、肝素锂抗凝血浆、汗、粪便、尿及胃肠液均可作为测定钠钾样品。

血清或血浆可在2～4℃或冰冻保存。

钾测定结果明显受溶血的干扰，因为红细胞中钾比血浆钾高二十几倍，故样品严格防止溶血。血浆钾比血清低0.1～0.7mmol/L，这种差别是由于凝血过程中血小板破裂释放钾之故。

钠的测定受溶血影响很小。

全血未及时分离或冷藏均可使血钾上升。

(二)方法学

钾、钠的测定方法有：火焰光度法、离子选择电极法、冠醚法和酶法。

氯的测定方法有：离子选择电极法、硫氰酸汞比色法、硝酸汞滴定法和电量分析法(库仑滴定法)

1.火焰光度法：

Na+、K+测定可采用火焰光度法。

原理：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析。

该法可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，该方法属于经典的标准参考法，

优点是结果准确可靠，广为临床采用。

通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标准法。

(内标法是标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素进行测定，一般是加入锂内标，测定的是锂/钠或锂/钾电流的比值，而不是单独的钠或钾的电流，这样，可减小燃气和火焰温度波动等因素引起的误差，因而有较好的准确性。)

2.化学测定法：

Na+和K+的化学测定主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠醚，均为离子载体，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。

Cl-的化学测定法：采用Fe存在下，Hg(SCN)2与Cl-反应生成与Cl-等当量的SCN，再与铁结合成Fe(SCN)的红色化合物，进行比色，定量标本中Cl-的含量。该法测定时，血清中性因素如F、Br和I也可以起反应;其量很少，故可忽略不计。某些药物及胆红素均对其有影响。以上比色法均可在自动生化分析仪进行批量测定，属临床常用的一种方法。

3.离子选择电极法(ISE法)：

原理：离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一个对特定离子具有选择性响应的敏感膜，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内，其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得未知溶液的离子活度，

优点;ISE法具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点。是目前所有方法中最为简便准确的方法。

缺点：电极具有一定寿命，使用一段时问后，电极会老化。

4.整合滴定法：

Cl-可采用特定的整合剂滴定法进行，

Molrr法：以KrCrO4,为指示剂，用AgN03滴定血清中Cl-。

Sehales法：以二苯卡巴腙作指示剂，用Hg(N03)2滴定血清中Cl-。滴定法需要熟练的操作，终点要准确，尽可能排除主观因素的干扰，否则误差很大。

干扰因素较多，难以得到准确的结果，目前已很少应用。

5.酶法：

酶法测定钠的原理是利用钠依赖的β-半乳糖苷酶催化人工底物ONPG(邻硝基酚β-D-吡喃半乳糖苷)，分解释放出有色产物邻硝基酚，在波长420nm处测吸光度变化。

酶法测钾的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶Ⅰ的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下降。

酶法测氯的原理是利用氯使α-淀粉酶与钙离子结合变成有活性的形式，然后与α-和β-葡萄糖苷酶共同催化人工合成底物2-氯4-硝基苯酚-口-D麦牙庚糖苷(CNP-G7)使其水解产生2-氯4-硝基苯酚，此产物在波长405nm处有最大吸收，血氯浓度与α-淀粉酶活性成正比，同时也与2-氯4-硝基苯酚的生成量成正比。

酶法的优点是不需特殊仪器，缺点是价格较贵。

羊胎盘提取技术发明专利在中国分布给谁了？

羊胎盘提取技术发明专利在中国分布给谁了？现如今，肽类产品受到越来越多人的青睐，6月2日，记者来采访了广州肽好生物科技有限责任公司总工程师的研发主任来讲述小分子美容肽的应用。

肽是什么?有人凭借着发现活性肽以及活性肽的作用，就获得了诺贝尔生物学奖。1902年，伦敦的两位生物学家在动物的肠胃内发现了可以溶解合成蛋白质的物质，此物质最初叫胰泌素，这个是肽的雏形，也是肽的起源。从1902年至今，肽的研发生产已经走过了百年的历史，并且再次期间已经有数十位科学家，生物学家，医药学家因研究肽而获得了诺贝尔奖，国内研究肽领域的专家学者也在悄然兴起，其中就包括郝在林工程师。

郝在林，女，1970年出生，河北省张北县人。1992年毕业于内蒙古工业大学化学工程系。现任广州肽好生物科技有限责任公司总工程师兼自治区级企业研发中心主任。

从1992年毕业至2020年，一直在生产科研一线工作，立足于锡盟畜牧业资源优势，致力于生物工程领域的研究和产品开发工作，先后研制开发了四大系列70多个高科技肽类产品，涉及肽保健食品、肽食品原料、肽乳制品、多肽草本饮品、小分子美容肽化妆品等多个领域。获得了五项发明专利，(肽奶及其制备工艺(02153205.2)、肽奶粉及其制备工艺(02153207.9)、乳酸菌肽奶饮料及其制备工艺(02153206)、一种多肽杏仁奶及其制备方法(200510077101X)。脑肽及其制备工艺(200710118548.6)

个人获得了两项自治区科技进步三等奖，(新型保健食品肽奶的开发、羊脑肽提取技术及其产品开发研究。)

是肽类研发国家星火计划项目、国家火炬计划项目技术总负责人。

2016年开始与河南中医药大学王振亮教授合作着手多肽草本饮品的研发。

2019年应邀参加《见证华商》高端访谈栏目，面对面对话央视主持人陆梅讲解小分子美容肽是如何美容祛斑的。

2002年至2019年，郝在林工程师在生物肽及其系列产品的研发中取得巨大的成功，研发的产品包括颐宁多肽保健食品、新型保健食品肽奶系列产品、牛羊脏器提取生物活性肽系列产品，与中科院医药研究所合作的肽类药物开发，以及羊胎盘提取生物肽系列化妆品等等。

郝在林工程师在生物肽领域的科研，已经广泛应用到生物肽系列产品的生产中，其牵头研发的太宜人小分子活性肽，小分子羊胎盘肽祛斑、抗衰太宜人系列化妆品，成为了深受广大爱美女性追捧的祛斑、抗衰美容圣品。郝在林工程师仍旧一如以往，将自己的全部热情投身于活性肽领域的研究之中，不断地探索创新，勇攀科研高峰。

常用的工业酶有哪些?

酶制剂工业是知识密集的高科技产业,是生物工程的经济实体.据台湾食品工业发展研究所统计,全世界酶制剂市场以年平均11 %的速度逐年增加.从1995 年的12. 5 亿美元增加到1999 年的19. 2 亿美元,预计到2002 年市场规模将达到25 亿美元.就酶在各领域的应用来说,食品、饲料工业用量最大,占销售总额的45 % ,洗涤剂占32 % ,纺织工业占11 % ,造纸工业占7 % ,化学工业占4 %.权威部门预测1997 年至2002 年,5 年中酶制剂市场的发展趋势,食品用酶将由7. 25 亿美元增至11. 76 亿美元,年增长率11. 4 %;洗涤剂用酶将由4. 89 亿美元增到8. 48 亿美元,年增长率13. 3 %;纺织用酶将由1. 65 亿美元增到2. 58 亿美元,增长率10. 3 %;造纸工业用酶将由1 亿美元增加到1. 92 亿美元,年增长率为最高,达到16. 2 %;化学工业将由0. 61 亿美元增加到0. 96 亿美元, 年增长率10. 5 %.与1985 年时,食品工业用酶占酶制剂市场62 % ,洗涤剂用酶占33 % ,制革纺织工业用酶占5 %相比,其明显的变化是,非食品工业用酶领域在迅速扩大,反映了人们对环保意识的增强.

在全世界上百个有名的酶制剂企业中, 丹麦NOVO 公司牢牢把持着龙头地位,占有50 %以上市场份额,杰能科则其次,占25 %左右市场份额,其它各国酶制剂生产企业分享余下的25 %市场份额.

工业上使用的酶制剂基本上分为二类:一类是水解酶类,包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、乳糖酶等,占有市场销售额的75 %以上.目前约有60 %以上的酶制剂已用基因改良菌株生产,NOVO 公司使用的菌种有80 %是基因重组菌株.第二类是非水解酶,占市场销售额10 %左右,并有逐年增大的倾向,主要是分析试剂用酶和医药工业用酶.

食品工业中,用于淀粉加工的酶所占比例仍是最大,为15 %;其次是乳制品工业,占14 %.酶在食品、纺织、制革工业等传统的应用虽然已相当广泛,技术上也已很成熟,但是仍在不断发展.以下就近年来对酶的生产安全与在工业应用方面的新发展作一简单介绍:

1 酶制剂生产的安全卫生管理

我国加入WTO 在即,对于酶制剂生产的安全卫生管理不可不加注意.食品用酶制剂国外是作为食品添加剂的,对其安全卫生规定很严.酶本身虽是生物产品,比化学制品安全,但酶制剂并非单纯制品,常含有培养基残留物、无机盐、防腐剂、稀释剂等.在生产过程中还可能受到沙门氏菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌之污染.此外还可能会含生物毒素,尤其是黄曲霉毒素,即使是黑曲霉,有些菌种也可能产生黄曲霉毒素.黄曲霉毒素或由于菌种本身产生或由于原料(霉变粮食原料) 所带入.此外培养基中都要使用无机盐,难免混入汞、铜、铅、砷等有毒重金属.为保证产品绝对安全,对原料、菌种、后处理等道道工序都要严格把关.生产场地要符合GMP(Good Manufactur2ing Practice 即良好的生产规程) 要求.对酶制剂产品的安全性要求,联合国粮农组织(FAO) 和世界卫生组织(WHO) 食品添加剂专家委员会(Joint FAO/ WHO Expert Committee on Foodadditives , J ECFA) 早在1978 年WHO 第21 届大会提出了对酶制剂来源安全性的评估标准:

(1) 来自动植物可食部位及传统上作为食品成份,或传统上用于食品的菌种所生产的酶,如符合适当的化学与微生物学要求,即可视为食品,而不必进行毒性试验.

(2) 由非致病的一般食品污染微生物所产的酶要求作短期毒性试验.

(3) 由非常见微生物所产之酶要作广泛的毒性试验,包括老鼠的长期喂养试验.

这一标准为各国酶的生产提供了安全性评估的依据.生产菌种必须是非致病性的,不产生毒素、抗生素和激素等生理活性物质,菌种需经各种安全性试验证明无害才准使用于生产.对于毒素之测定,除化学分析外,还要做生物分析.英国对添加剂的安全性是由化学毒性委员会

(简写COT) 进行评估的,并向政府专家咨议委员会FACE(食品添加剂和污染委员会) 提出建议.COT最关心的是菌种毒性问题,建议微生物酶至少做90天的老鼠喂养试验, 并以高标准进行生物分析.COT 认为菌种改良是必要的,但每次改良后应作生物检测.美国对酶制剂的管理制度有二种: 一是符合GRAS( General recognized as safe) 物质;二是符合食品添加剂要求.被认为GRAS 物质的酶,在生产时只要符合GMP 就可以.而认为食品添加剂的酶,在上市前须经批准,并在联邦管理法典(CFR , TheCode of Federal Regulation) 上登记.申请GRAS 要通过二大评估,即技术安全性和产品安全性试验结果的接受性评估.GRAS 的认可除FDA 有权进行外,任何对食品成份安全性具有评估资格的专家也可独立进行评估.在美国用以生产食品酶的动物性原料,必须符合肉类检验的各项要求,并执行GMP 生产,而植物原料或微生物培养基成份在正常使用条件下,进入食品的残留量,不得有碍健康.所用设备、稀释剂、助剂等都应是适用于食品的物质.须严格控制生产方法及培养条件,使生产菌不致成为毒素与有碍健康之来源

此外,近年来世界食品市场推行KOSHER 食品认证制度,即符合犹太教规要求的食品制度.有了KOSHER 证书,才可进入世界犹太组织的市场.在美国不仅是犹太人,连穆斯林、素食者、对某些食物过敏的人,大多数也购买KOSHER 食品.按规定KOSHER 食品中不得含有猪、兔、马、驼、虾、贝类、有翼昆虫和爬虫类的成份.加工KOSHER 食品的酶制剂同样要符合KOSHER 食品的要求.故国外许多食品酶制剂都有符合KOSHER 食品的标记.要将我国酶制剂向海外开拓,对此不可不加以注意.符合KOSHER 食品要求由专门权威机构审批,比FDA 还严.

2 酶在工业中的新用途

2. 1 功能性低聚糖的制造

近20 年来,以双歧杆菌、乳酸菌为主的益生菌和以低聚果糖、异麦芽糖、低聚半乳糖为首的益生原作为新一代保健食品在世界各国广泛流行.通过酶法转化的各种功能性低聚糖年销售量已超过10 万吨.功能性低聚糖是指那些人体不消化或难消化吸收的低聚糖,摄取后直入大肠,选择性地被人体自身的有益菌(双歧杆菌等) 所优先利用.使体内双歧杆菌成倍、上百倍地增殖而促进宿主的健康,故也称为双歧因子.这些低聚糖也不被龋齿病源突变链球菌所利用,食之不会引起蛀牙.每天摄取3～10 g 功能性低聚糖,可改善胃肠功能,防止便泌和轻度腹泻,减少肠内毒素生成和吸收,提高机体抗病免疫功能.功能性低聚糖正在成为21 世纪流行的健康糖源.

(1) 异麦芽低聚糖:是难消化低聚糖,不被唾液、胰液所分解,但在小肠可部分被分解和吸收.热值约为蔗糖和麦芽糖的70 %～80 %.对肠道直接刺激性较小.小鼠急性毒性试验LD50 为44g/ kg 以上,安全性不逊于蔗糖和麦芽糖.人体最大无作用量1. 5 g/ kg (摄取后24 小时不发生腹泻之上限量) ,而其它难消化低聚糖或糖醇的最大无作用量只有0. 1～0. 4 g/ kg.摄取异麦芽糖16g ,一周后肠道中双歧杆菌、乳酸菌等有益菌明显增加,而拟杆菌、梭状杆菌等有害菌受到抑制,便秘改善,粪便pH 下降,有机酸增加,腐败物减少.小鼠试验表明,摄取异麦芽糖后免疫力增强,血脂改善.异麦芽糖在高温、微酸性和酸性环境下稳定,可以添加于各种食品和饮料中.

异麦芽低聚糖是淀粉经α- 淀粉酶液化,β- 淀粉酶糖化和α- 葡萄糖苷酶转苷反应而生成的包括含α- 1 ,6 键的异麦芽糖,潘糖,异麦芽三糖等分枝低聚糖的糖浆.市场上的异麦芽糖分含量50 %与90 %两种,后者是将含量50 %的异麦芽糖用离子交换法或酵母发酵法去除葡萄糖而成.粉状糖是糖浆经喷雾干燥而成.

生产异麦芽糖的α- 葡萄糖苷酶是黑曲霉生产糖化酶之副产品,将糖化酶发酵液经离子交换吸附去除所含α- 葡萄糖苷酶经洗脱浓缩而成.虽然发表过不少培养黑曲霉生产α- 葡萄糖苷酶的研究的报道,但未见用于商品生产.用α- 葡萄糖苷酶转化麦芽糖生产异麦芽低聚糖,其生成量一般仅50 %左右,另外还含有20 %～40 %的麦芽糖与葡萄糖.为了提高异麦芽低聚糖产量,曾有不少研究报导,例如使用臭曲霉α- 葡萄糖苷酶,产品中潘糖产量可达30 %葡萄糖量可降至20 %.高崎发现脂肪嗜热芽孢杆菌所产普鲁兰酶在高浓度麦芽三糖存在下有转苷作用.将其结构基因导入枯草杆菌NA - 1 ,生产的新普鲁兰酶,与枯草杆菌糖化型α- 淀粉酶(可产生麦芽三糖) 一起作用于淀粉,异麦芽低聚糖的产率可达60 % ,而葡萄糖含量由40 %降至20 %.为了提高黑曲霉α- 葡萄糖苷酶的活力,东京大学生物工程系将α- 葡萄糖苷酶基因AGLA 导入黑曲霉GN - 3 ,得到转化子GIZ 155 - A3 - 4 ,产酶能力提高了11 倍.

目前我国生产异麦芽糖的企业多达50～60 家,生产能力约5 万吨以上,α- 葡萄糖苷酶的用量以0. 1 %计,需50 吨,消耗外汇甚巨(以每吨75 万元计,就需3750 万元人民币) .有必要立足自给.

(2) 海藻糖:是二分子葡萄糖以α,α- 1. 1 键连结而成的非还原性低聚糖.广泛存在于动植物和微生物(如菌覃、海藻、虾、啤酒酵母、面包酵母) 中,是昆虫主要血糖,作为飞翔时之能源来利用.海藻糖能保护某些动植物适应干燥和冰冻的环境.海藻糖是一种很好的糖源,因非还原性,故耐酸耐热性好,不易同蛋白质、氨基酸发生反应.对淀粉老化,蛋白质变性,脂肪氧化有较强抑制作用.此外还可消除某些食物之苦涩味、肉类之腥臭.海藻糖不被龋齿突变链球菌利用,食之不会引起蛀牙.活性干酵母的活存率全赖酵母细胞中海藻糖含量所决定.过去海藻糖系从酵母中提取(最大含量也只有20 %) ,成本甚高,每公斤高达2～3 万日元.现在可以用酶或发酵法生产,成本大大下降.久保田等从节杆菌、小球菌、黄杆菌、硫化叶菌等土壤细菌中发现一组海藻糖生成酶(海藻糖合成酶 MTSASE 与麦芽低聚糖海藻糖水解酶MTHASE) ,当将其同异淀粉酶、环糊精生成酶、α- 淀粉酶、糖化酶一起作用于液化淀粉时,可得到85 %收率的海藻糖.

(3) 帕拉金糖( Palatinose) 学名为异麦芽酮糖( Isomaltotulose) :以蔗糖为原料,经产朊杆菌或普利茅斯沙雷氏菌的α- 葡萄糖基转移酶(又称蔗糖变换酶Sucrose multase) 的作用,蔗糖分子的葡萄糖和果糖由α- 1 ,2 键结合转变为α- 1 ,6 键结合而成.由于结构的改变,其甜度减少到蔗糖之42 % ,吸湿性较低,对酸的稳定性增加,耐热性略为降低,生物学、生理学特性发生改变,不能为多数细菌、真菌所利用.食后不被口腔、胃中的酶所分解,直到小肠才可被酶水解成为葡萄糖和果糖而进入代谢.帕拉金糖不为口腔龋齿突变链球菌所利用,食之不易发生蛀牙,食后血糖也不会迅速升高,故可为糖尿病人使用.

帕拉金糖在低水份和低pH 下便会失水而缩合成为2～4 个分子的低聚帕拉金糖,甜度为蔗糖之30 % ,不为肠道消化酶所消化,食后可直达大肠而为双歧杆菌选择性利用,起到双歧因子的保健作用.将帕拉金糖在高温高压下,用雷尼尔镍为催化剂氧化便生成帕拉金糖醇.这种糖醇甜度为蔗糖的45～60 % ,热值为蔗糖的二分之一.食后不易消化吸收,不会引起血糖和胰岛素升高,不会引起蛀牙,适合糖尿病人、老人、肥胖者作甜味剂.因其物理性质酷似蔗糖,可用其制作低热值糖果,是国际上流行的新一代甜味剂.上述三种糖在欧美、日本等已经大量生产,并被广泛利用;而在国内虽已研究成功,但在生产和应用上尚存在不少阻力.

(4) 低聚果糖:是以蔗糖为原料经黑曲霉β2果糖基转移酶的作用,将蔗糖分子的D2果糖以β22 ,1 链连接123 个果糖分子而成的蔗果三糖、蔗果四糖以及蔗果五糖与蔗糖、葡萄糖以及果糖的混合物,甜度为蔗糖的60 %.用离子交换树脂将其中葡萄糖与果糖除去后,可得到含低聚果糖95 %以上的产品,甜度为蔗糖的30 %.低聚果糖的主要成份蔗果三糖与蔗果四糖在人体中完全不被唾液、消化道、肝脏、肾脏中的α2葡萄糖苷酶水解,本身是一种膳食纤维,食后可直达大肠,为大肠中的有益细菌优先利用.食低聚果糖不会引起血糖、胰岛素水平的升高,热值为1. 5kCal/ g ,通过双歧杆菌的增殖,肠道得以净化,肌体免疫力增强,营养改善,血脂降低.以年龄50～90 岁老人进行试验,日食低聚果糖8g ,8 天后肠道双歧杆菌可由5 %增加到25 %.便秘者食用低聚果糖每天5～6g ,4 天后80 %便秘者症状改善,粪便变为柔软,色泽转黄,臭味减少,肠道腐败得到控制.

低聚果糖也存在于菊芋、菊苣、芦笋等植物,西欧都用菊粉做原料,用菊粉酶局部水解而成.日本政府将低聚果糖批准为特定保健食品;西欧、芬兰、新加坡、台湾等地将低聚果糖作为功能性食品配料,广泛使用在各种食品.我国大陆低聚果糖的年生产能力为15000 吨,广东江门量子高科10000 吨,云南天元3000 吨,张家港梁丰1000 吨,广西大学奥立高500 吨.此外五粮液酿酒公司、上海中科生物医学高科技开发有限公司也在销售.

(5) 低聚木糖的特点是对酸、热稳定性强,故可用于果汁等酸性饮料,因其不被多数肠道细菌利用,只有双歧杆菌等少数细菌能利用,因此是一种强力双歧因子,每天摄取0. 7g 即可见效.这种糖是以玉米芯为原料,提取其木聚糖后,用曲霉木聚糖酶水解而得.由日本三得利公司首先生产,我国山东龙力公司在中国农大的支持下开发成功.山东食品发酵研究院亦已宣告研制成功.此外,其它功能性低聚糖如低聚半乳糖,低聚甘露糖等我国也已开发成功.

2. 2 酶用于功能性多肽的生产

近年发现蛋白酶水解蛋白质生成的肽类,其吸收性比蛋白质或由蛋白质的组成的氨基酸为好,因此可作为输液、运动员食品、保健食品等.在蛋白质水解物中,有些肽具有生理活性功能,如酪蛋白经胰酶或碱性蛋白酶水解可生成酪蛋白磷酸肽(CPP) ,具有促进Ca 、Fe 吸收的功能.由鱼肉、大豆、酪蛋白经酶水解得到的水解物中含有一种氨基酸,序列是Ala - Val - Pro - Tyr - Pro - Gln - Arg 的七肽,是一种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI , An2giotensin Converting Enzyme Inhibitor) .它可同血管紧张素相结合影响其活性的表达,从而防止血压升高,是较理想的降压保健食品.由不同蛋白质原料,不同的蛋白酶水解得到不同结构的肽类中,有些肽还具有降血脂,促进酒精代谢、抗疲劳、抗过敏的生理功能.常食豆酱、豆豉、纳豆、乳腐等酿造食品有益健康,原因也在此.胨是细菌培养基原料,因发现其有生理功能,竟

然也有人将它装入胶囊,当保健品销售,获利甚丰.

2. 3 酶用于油脂工业

酶在油脂工业上的应用还处于萌芽阶段.(1) 纤维素酶、半纤维素酶用于榨油工业:油料用溶剂抽提油后,残渣中残留溶剂很难完全去除,影响饲料应用,为此日本开发了采用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶分解植物组织,来提取油脂.方法是将油橄榄、菜籽等先经破碎或热处理,然后加半纤维素酶反应数小时,离心分离油脂和渣粕.这种工艺已用在橄榄油、桔油提取上,菜籽油已进入中试阶段.在动物油脂生产上,利用蛋白酶处理,使蛋白质同油脂分离,因可避免高温处理,油脂的质量也就更好.为了去除油脂残余卵磷脂,使用磷酸酯酶去除油中水溶性卵磷脂.

(2) 制造脂肪酸

脂肪酶对底物有位置专一性和非专一性之分,此外对底物脂肪酸链长、不饱和度也有选择性,用对位置无专一性脂肪酶水解猪油生产脂肪酸,作为制造肥皂的原料.用对不饱和脂肪酸酯无作用的脂肪酶,水解鱼油时,因对高度不饱和脂肪酸DHA 的甘油三酯难水解而保留下来,用此法来制造DHA 等ω3 脂肪酸.

(3) 酯交换

利用脂肪酶之酯交换作用,改变油脂脂肪酸组成可改变油脂性质,例如用棕榈油改性成为可可脂.

2. 4 转谷酰胺酶( TGASE) 用于肉类加工转谷酰胺酶可催化蛋白质分子中谷氨酸残基上γ2酰胺基和各种伯胺间的转酰基反应,当蛋白质中赖氨酸残基的ε2氨基作为酰基受体时,可在分子间形成ε2(γ2Gln) Lys 共价键而交联,从而可增加蛋白质之凝胶强度,改善蛋白质结构和功能性质,利用此作用,可将低值碎肉重组,改善鱼、肉制品外观和口感,减少损耗, 从而提高经济价值.还可将Met .Lys. 等必须氨基酸导入缺乏此氨基酸的蛋白质而改善营养价值.此酶也可用于毛织物加工,用于酶的固定化或将不同分子进行联结,将抗体与药剂进行联结等.生产菌种为茂原链轮丝菌( S t reptoverticill ummobaracens) ,日本已商业化生产,我国无锡轻工业大学也已研究成功,转入试生产阶段.

2. 5 酶在果蔬加工上的新用途

(1) 原果胶酶用于果胶提取:

果实中的果胶在未成熟前是以不溶性的原果胶形式存在的,在水果成熟过程中逐渐转变成可溶性之果胶.原果胶也可在酸、热作用下转变为可溶性.由枯草杆菌、黑曲霉、酵母、担子菌所生产的原果胶酶已被开发用于桔皮、苹果、葡萄皮、胡萝卜中果胶的提取.用酶法提取果胶与酸热法相比工艺简单,无污染,成本低,产品质量除含糖量稍高外,无甚区别.

(2) 粥化酶(Macerating enzymes) 之用于提高果

汁得率:

粥化酶是果胶酶、半纤维素酶(包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶) 、纤维素酶之混合物,作用于溃碎果实,对促进过滤,提高果汁收率的效果比单一果胶酶为好.已是果汁加工主要的酶.

(3) 真空或加压渗酶法处理完整果蔬:

利用加压或真空浸渍果蔬,使果胶酶渗入细胞间隙或细胞壁中而起作用.此法已用于完整桔子的软化,桔皮容易剥除.还用于桃肉硬化处理,将果胶甲基酯酶与 Ca2 + 渗入桃肉,可使罐头糖水桃子硬度提高4 倍(因脱甲酯之果胶可同Ca2 + 结合而增强硬度) .腌制蔬菜用此法处理可防止软化而保持脆性.此法也用于桔皮之柚苷酶脱苦处理, 脱苦率达81 %.

(4) 柒酶用于去除酚类化物

澄清果汁经超滤过滤,浓缩后仍发生白色混浊,此乃由于果汁中酚类化合物所引起,为此在过滤前可用柒酶处理,使之氧化聚合成不溶性高分子而过滤去除之.

(5) 果胶酶用于洗清滤膜果胶污染物.

(6) β2葡聚糖酶用于去除葡萄汁中由感染Cot rytis cinerea 而产生的β- 葡聚糖,Vinozyme促使不溶物沉降.

2. 6 酶在纺织工业上的应用

棉布用淀粉酶退浆已有100 多年历史了,随着酶制剂工业的发展,纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、柒酶、蛋白酶等酶类先后被纺织工业所采用.

(1) 棉布整理用酶

随着牛仔服的流行,纤维素酶整理棉布,改善织物观感和手感,已受到纺织业的广泛重视.纤维素酶作用于天然纤维非结晶区,使纤维发生部分降解和改性,可使织物柔软、光洁、手感和外观舒适.通常用酶处理以后,棉布重量减轻3～5 % ,但牢度要损失20 %左右.在发达国家为追求时尚,不在乎布的牢度.

过氧化氢酶常用于经H2O2 漂白后除去残留的H2O2 , 最近发现A rthromyces ramosus , 鬼伞菌Coprinus cinereus可大量生产过氧化氢酶,过氧化氢酶也用于洗涤剂.果胶酶用于棉布整理,主要是分解棉、麻织物纤维表面的果胶,以利漂白与染色.柒酶是种酚氧化酶,以O 为H 受体,主要用在牛仔布靛蓝染色时脱色处理,NOVO 公司采用基因技术改良黑曲霉生产.柒酶也可作用于木质素,有分解木质素的作用.木聚糖酶用于布坯漂白处理,可去除木质素及粘附纤维上之棉子壳.

(2) 毛织物蛋白酶防毡缩整理

毛织品若不经整理水洗后便发生收缩毡化不能再穿(如劣质羊毛衫洗涤后缩得很小) ,必须防缩防毡化处理,洗后才能保持原状.防毡化防腐处理已有100 多年历史,过去用氯、H2O2 、过硫酸盐处理,污染严重,90 年代才开发了无氯防缩剂.利用蛋白酶改变羊毛结构可用于防毡防缩处理,40 年代就有人研究,60 年代日本报道,用木瓜酶处理可防毡缩,并可进行低温染色,提高染色率,减少污水,改善毛织物手感和观感.70 年代我们也曾试用酸性蛋白酶处理,进行低温染色,取得良好结果,染色率提高3. 6 % ,污水减少62 %.每千锭断纱率降到145 根,抗伸力、抗拉力、手感都有明显提高.80 年代以来,酶法防毡缩在国内外重新引起重视,日、英、美等国发表了大量研究文章,取得了一定进展.研究过的蛋白酶有胰酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等,相信不久这些工艺会成熟而得到推广.

2. 7 酶在造纸工业上的应用

造纸工业是环境污染的重要源头.随着人们对环保意识增强,造纸工业使用生物技术受到了重视.酶法生产纸浆引起了各国浓厚兴趣,关键是降解木质素.最近国内有人利用多种微生物作用制造纸浆,已经取得可喜进展,目前正在筹备扩大试验.酶在造纸工业的应用现在主要是脂肪酶用于原木脱树脂,纤维素酶半纤维素酶和脂肪酶用于废报纸回收后脱油墨;以及木聚糖酶用于纸浆漂白.

(1) 原木脱树脂:

造纸用的原木因含树脂,打浆抄纸时,树脂污染设备,影响生产,降低纸品质量.为此需要在室外堆放很长时间(3 个月以上) ,使树脂分解.这样影响生产周期,还占用大片场地.日本造纸研究机构对原木成份进行研究,发现树脂的成份中96 %是油酸和亚油酸,使用脂肪酶处理就可除去.自从90 年代在生产上采用后,纸品的质量提高,原木堆积成本下降,树脂吸附剂用量减少,经济效益提高.当时所用脂肪酶由NOVO 公司供应,在pH6～10 ,40～60 ℃作用良好,近来又发现使用耐热性70 ℃的脂肪酶效果更佳.

(2) 纸浆漂白:

纸浆为了除去色素来源木质素,要用氯、次氯酸、二氧化氯等氯化物处理,污染严重,因此60 年代就有人考虑用木质素酶将其分解.木质素是以苯基丙烷为骨干的高分子聚合物,只有将其分解木质素才会崩解.已发现对木质素有分解力的酶有木质素过氧化酶 (L IP) 、锰依赖性过氧化酶(MNP) 、柒酶(LAC) ,但至今未找到适用的木质素酶.近年芬兰提出了一种化学和酶法相结合的处理法,取得了较好的效果.先用木聚糖酶切断木质素同纤维素之间的联系物(木聚糖和半纤维素) ,使木质素游离,再用碱蒸煮后,由纸浆游离出的木聚糖可再次吸附在纤维的表面,用木聚糖酶将其分解,可增加孔隙,于是氯素的浸透性提高,并使木质素容易从纸浆内部出来,此工艺活性氯用量可减少30 %.

(3) 废报纸回收利用中的脱墨

废纸回收后打纸浆时,需用碱、非离子表面活性剂、硅酸钠及H2O2 进行脱墨处理.日本在脱墨时添加碱性纤维素酶、半纤维素酶0. 1 %反应2 小时,抄纸白度可提高4～5 % ,强度并未降低.由于防止油墨印刷品弄脏手,油墨中加有亚油酸、亚麻酸和油酸等的高级三甘油酯,故脱墨时再添加脂肪酶效果更好,白度可提高2. 5 %.废报纸脱墨,我国山东大学也进行过不少研究.

2. 8 其它

植酸酶除作为饲料添加剂用以提高饲料中有机磷的利用率,减少粪便中磷对环境的污染,节省饲料另加磷酸盐用量.近年植酸酶还用于酿造,以改善原料中磷的利用,以及用于去钾大豆蛋白食物的生产,成为肾脏病人蛋白质的来源.α- 葡萄糖基转移酶还用于甜叶菊加工,用以脱苦涩味.淀粉的液化和糖化几乎占了工业上酶反应的绝大部分,由于目前的酶液化、糖化要在不同pH 和温度下进行,为简化工艺、节省水和能源,有必要开发耐酸性高温α2淀粉酶和耐热性糖化酶,如果α2淀粉酶可在pH4. 5 时进行液化,而糖化酶能在60 ℃以上温度下进行,试想将这些带来多大的效益? 不仅如此在pH4. 5 液化,还可避免麦芽酮糖生成.耐酸性α2淀粉酶和耐热性糖化酶在国外已经进行多年研究,已有不少报道.例如日本报道已选育出一株耐酸性α2淀粉酶( KOD - 1) ,在30 %淀粉浆中,pH4. 5 ,105 ℃下反应10 分钟,残留酶活75 %.将该酶在pH4. 5 ,60 ℃时液化30 %粉浆60 分钟,得到DE14 液化液,加糖化酶0. 1 %糖化48 小时,葡萄糖含量达95. 5 % ,与对照枯草杆菌α2淀粉酶的结果于pH5. 8 液化者相同(葡萄糖含量95. 7 %) .此外,利用蛋白质工程将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶分子中7个蛋氨酸用其它氨基酸置换后,耐酸性增强.这类酶的产业化一旦成功,将大大改变糖化有关工业的面貌.

3 结束语

随着世界能源的日益减少,而人口却在不断增加,水资源和粮食日见短缺.由于人类对环保意识的加强,使得工业界用酶来改革传统工艺的需求更为迫切.因此,提高酶的产量,降低生产成本,开发酶的新品种、新用途更是当务之急.基因工程、蛋白质工程的发展,为酶制剂工业发展创造了有利条件.开发耐热、耐酸碱,对底物有特殊作用的酶,以及将动植物生产的酶改由微生物发酵方法来生产,或者将还不能使用的微生物所产的酶改由安全菌种来生产,都将成为现实.

蛋白的表达与纯化

pET，原核表达金标准（转）

pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

· 是原核蛋白表达引用最多的系统

· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制

· 提供各种不同融合标签和表达系统配置

· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物

· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统概述

pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导 λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性 T7 lac 启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。

选择 pET 载体

所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。

选择要点

选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

· 所表达蛋白的用途

· 所表达蛋白的已知信息

· 克隆策略

pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b （ + ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

pET NusA 融合系统 43.1

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的 pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000 个以上蛋白进行可溶性建模， NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA 融合蛋白进行的试验中，大于 85% 的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1 载体含有 Nus.Tag 融合伴侣并与 trx/gor 突变体 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1 载体和这些 trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侣

· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可选择的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合标签

· 凝血酶和肠激酶切割位点

· 多克隆位点位于所有读码框中

· 与 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET 宿主菌株感受态细胞

所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

（ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue 适合用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。

Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。

重组蛋白的纯化

净水器十大名牌排行榜？

1、汉斯顿净水器

净水行业专业领导者，较早专业从事净水行业的品牌，拥有众多核心技术，为行业提供75%以上的超滤膜滤芯和能量滤芯以及RO滤芯，同时参与世界上90%以上的海水淡化、污水处理等重大项目。汉斯顿在净水行业是有不少核心技术的，其它很多品牌多种类型的滤芯都由汉斯顿提供，甚至有很多净水器是翻版汉斯顿的滤芯技术。

2、海尔净水器

海尔和美的都是国内品牌中名气最大的企业之一。想必也是众所周知的一个品牌，海尔很多家电都很不错，导致很多人一买家电就想买海尔的产品。

海尔和美的都是品牌大，企业大，虽然在净水器行业并不是深耕多年的专业者，但是海尔毕竟是大品牌，也可以说是国内最有良心的企业之一，海尔净水器品质各方面还是非常不错的，售后也是非常好，性价比也是这里十大品牌中最高之一，同等配置的产品，价格甚至只有其他品牌的一半，由于是人人皆知的国产大牌，销量能排天猫前三名。海尔的产品还是非常值得推荐的。

3、滨特尔净水器

滨特尔净水器是GE（美国通用电气）和滨特尔合资成立的，GE是世界500强排名前26位的企业，同时也是世界3大净水供应商之一（三大滤芯品牌分别为：GE、陶氏、海德能），比如小米，美的，海尔等众多大品牌都是使用的GE膜。

滨特尔主要业务就是从事水科技领域，从美国白宫到英国白金汉宫，从马来西亚双子塔到科威特皇宫，从迪士尼乐园到星巴克，都有用滨特尔的净水设备。

4、安吉尔净水器

最受顾客喜爱的品牌之一，中国较早的饮水设备研究与开发、制造及销售的专业公司。作为国内最早一批进入净水行业，也是国内首家拥有研发中心的净水器企业，多次参与制定了饮水方面的国家标准（含金量还是非常高的）。

产品大多均采用进口陶氏膜，品质毋庸置疑，品牌知名度非常不错，专业性也强，口碑也还不错，而且性价比非常高，算是净水器行业既专业又便宜的一个品牌。

5、怡口净水器

美国怡口是股神巴菲特旗下的伯克希尔•哈撒韦的下属公司产品。2017年世界500强第8名。无电双罐技术的鼻祖，业内公认的世界高端全屋净水品牌。怡口拥有11个全球生产基地及销售公司，4个研发中心，07年在中国昆山设立了生产基地。

美国进口的产品也是真心好，各种专利技术也非常牛，公司实力确实大，大到众多净水器以他为目标，净水器良心企业之一。

6、沁园净水器

推荐理由：民族大品牌，拥有无法超越的世界专利，更适合中国水质。大阅兵，中南海，奥运村选择的都是沁园。

虽然品牌很响，各种殊荣、技术，专利多，净水器行业中专业者之一，也是净水器知名度最高的品牌之一了，用的人也是非常多。但是，口碑较差，实际负面评价比例还是比其他品牌比例要高很多，非常多的人骂这个品牌垃圾。