血清外泌体mirna研究攻略（外泌体mirna测序）

本文目录一览：

• 1、Chapter1-miRNA
• 2、真核细胞中核酸存在于什么部位
• 3、circRNA研究应用专篇①：“sponge”与“biomarker”

Chapter1-miRNA

        植物miRNA受HEN1催化的3'端2'-O-甲基化作用而免受降解。拟南芥中HEN1的缺失导致大多数miRNA的积累减少以及miRNA大小异质性。水稻中也观察到了类似的结果。对拟南芥 hen1 突变体的进一步研究发现，3'至5'的截短和3'的尿苷化是miRNA降解的两个主要机制（图1）。实际上，这些机制也可用于动物体内的piRNA降解，例如果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、小鼠。因此，小RNA的3'甲基化是保护它们免于降解必不可少的普遍机制。尽管已经确定了小RNA降解所需的其他几个基因，但小RNA周转的全部范围仍不清楚。

        在拟南芥，水稻和玉米中，在 hen1 突变体中广泛观察到miRNA的3'尿苷化。拟南芥中的核苷酸转移酶HEN1 SUPPRESSOR 1（HESO1）和UTP：RNA URIDYLYLTRANSFERASE（URT1）将3'没有甲基化的miRNA尿苷化并促进其降解。 heso1 ， utr1 突变体会减弱miRNAs尿苷化的降解； hen1 突变体中，3'尿苷化程度增加且发育缺陷。在体外，HESO1和URT1具有向未甲基化的RNA添加U残基的能力，而RNA的3'甲基基团抑制了它们的活性。有趣的是，它们对体内miRNA底物有不同的偏好：HESO1和URT1分别偏爱U端和A端miRNA，这使未甲基化的miRNA（尤其是A端miRNA）。经历URT1催化的尿苷化，这使它们被HESO1的青睐。

        还已经鉴定出负责小RNA降解的核酸外切酶。反向遗传筛选和体外酶法测定表明，小分子降解核酸酶1（SDN1）表现出3'至5'核酸外切酶活性，并特异性地作用于短ssRNA 。 SDN1属于一个包含四个成员的家族。三个SDN成员的突变会导致严重的形态异常，并增加miRNA和siRNA的积累，表明SDN成员在降解小RNA方面具有冗余功能。尽管小RNA的3'甲基部分抑制核酸外切酶的活性，但已证明在hen1和野生型植物中，miRNA的3'截短均由SDN进行。通过比较miRNA图谱，在 hen1 突变体或缺失SDN1和SDN2的野生型植物中观察到3'截短的miRNA的积累减少。

        由于尿苷酸化的miRNA不能在体外被SDN1降解，因此应该有其他核酸外切酶降解尿苷化的miRNA。在其他真核生物中，已经鉴定出了几种以尿苷酸化的RNA为底物的核酸外切酶，eg：在哺乳动物中，DIS3-like2（DIS3L2），其在酵母中的直系同源物也能够降解尿嘧啶化的RNA ;在衣藻中，外泌体subunit Ribosomal RNA-Processing Protein 6（RRP6）表现出3'至5'核酸外切酶活性，并特异性作用于尿酸化的miRNA。体内RRP6的去除会导致小RNA的丰度增加，这暗示RRP6可能是降解尿苷化miRNA的核酸外切酶。因此，研究RRP6和DIS3L2的直系同源物将加快拟南芥中有利于尿酸化miRNA的核酸外切酶的发现。

      除了SDN1，HESO1和URT1在体内与AGO1相互作用。在体外，这三种蛋白质都能够尿苷化或截短与AGO1相关的miRNA，而修饰的miRNA保留在AGO1上。由于miRNA3'甲基化抑制了HESO1和URT1的活性，miRNA的3'甲基仅部分作用于SDN1 ，因此在AGO1结合的miRNA降解期间，SDN1去除miRNA的3'甲基，使未甲基化的miRNA有利于HESO1和URT1进行尿苷化，并且有未鉴定的核酸外切酶x降解U尾miRNA。此机制也可能适用于游离miRNA，或者SDN1可以直接降解游离miRNA。

Mode of action of miRNAs

植物miRNA转录后调控基因表达主要通过清除转录本和抑制表达两种机制。

miRNA-guided transcript cleavage

        通过序列互补识别靶标后，miRNA介导AGO1在靶标转录本miRNA的第10和11个核苷酸相对应的磷酸二酯键处裂解。 除了AGO1，其他AGO蛋白，包括AGO2，AGO4，AGO7和AGO10，也被证明具有裂解活性，这由AGO蛋白中的RNase H-like PIWI结构域决定的。

miRNA-mediated translation repression

        miRNA介导的转录物切割的广泛存在，植物中很少观察到miRNA指导的翻译抑制，eg： miR172和miR156 / 157分别调节AP2和SPL3是通过翻译抑制实现的。当miR172和miR156 / 157异常积累时，AP2和SPL3的转录本水平却与野生型相似，蛋白质水平发生了变化，于是有人提出miRNA介导的翻译抑制。后来，据报道还有其他几种miRNA以类似的方式调节其靶标，例如miR159 ，miR164，miR165 / 6 ，miR171，miR395，miR398和miR834 。而且，已经表明，miRNA通过抑制蛋白质合成而不是促进蛋白质降解来抑制其靶标的翻译。

        已经确定了与miRNA指导的翻译抑制有关的几个因素，包括微管切断酶KATANIN 1（KTN1）；加工体（P体）的组成部分VARICOSE（VCS）； 一种GW重复蛋白SUO；以及ER膜蛋白ALTERED MERISTEM PROGRAM 1（AMP1）。如果这些基因突变会改变miRNA靶标的蛋白质水平，而不会影响它们的转录水平，表明miRNA介导的翻译表达与转录物的切割无关。而且，大多数miRNA富集于膜结合的多核糖体上，这表明miRNA指导的转录物切割和翻译抑制在ER上发生。然而，转录物的切割也可能以与胞浆中多核糖体无关的方式发生。

miRNAs in plant development

miRNA介导的调控产生的影响被广泛研究。 植物中的许多miRNA靶标是调节多种生物过程的转录因子，包括莲座丛叶和根的发育，花的形态发生，茎顶端优势，激素信号传导，对干旱和高盐度的非生物胁迫响应以及植物对病毒和细菌的免疫。很多研究揭示了miRNAs在植物发育过程中的生物影响（图2，表1）

miRNA-mediated regulation of meristem organization and cell polarity

植物分生组织在可能在特定的生长区域中包含未分化的细胞。分生组织的细胞分化生成植物器官，并且细胞分化过程在分子水平上受到严格调节。作为基因表达的关键调控因子，miRNA及其功能是分生组织维持不可或缺的组成部分。植物的叶子从茎尖分生组织的外围区域产生，形成叶面叶腹，前后-轴和中-外极化结构。随着细胞分裂，扩展和分化，叶片发育不断发展。已知有几种miRNA可以调节分生组织的维持和叶片模式。 

花的发育是植物生长的重要阶段，它包括从营养生长到生殖生长的过渡。在拟南芥中，miR156/157，miR159和miR172等miRNA家族在开花过程中表现出调节功能。 miR156/157家族有10个保守的成员miR156a-h和miR157a-d，它参与生殖阶段的过渡。在此过程中，miR156/157的丰度下降，导致其靶基因 SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL） 的表达增加。一致地，miR156/157过表达导致开花延迟。单子叶植物中的miR156似乎参与了辅助分生组织的启动。在柳枝中，miR156-SPL调节分蘖。在玉米中，miR156调控 TSH4 可控制穗发育，这是谷物形成的重要过程；miR156-SPL还涉及植物中衰老途径的控制。在番茄中，响应赤霉素（GA）信号，miR156与miR319介导的途径一起调节了向开花的过渡，整合了两个无关的miRNA功能。

miR159参与了短日照条件下的开花期，通过GAMYB相关基因促进花期转变， MYB33 / 65/1101 是影响LEAFY活性的GA特异性转录因子。miR172通过其靶标 APETALA 2（AP2） 的翻译抑制参与花的发育。 miR172对开花的抑制作用在玉米，大麦，大豆和水稻中得到保留。

miRNA-mediated regulation of root architecture

植物根系能够吸收水分和养分，也是与土壤环境相互作用的场所。 根的发育受多个因素的精确调控。 在植物中，已知一些小RNA及其靶标参与侧根发育。 这些包括miR164及其靶标，即植物特异性转录因子 NAC1 DOMAIN CONTAINING PROTEIN 1 (NAC1) 它调节拟南芥和玉米的侧根形成。 同样在渗透胁迫下，过表达马铃薯中Stu-miR164导致StNAC262的表达减少，并限制了侧根的数量。 MIR165/166 编码的miR165a, miR166a, and miR166b在根分生组织的表皮中表达，限制靶基因 PHABULOSA（PHB） 在中央根细胞层中的表达，从而塑造根结构。 miR390在侧根起始位点的特异性表达触发了tasiRNA的产生，从而抑制ARF2/3/4，控制了局部生长素调节网络。反过来，miR390受到 ARF4 的抑制，和其他ARF的正调控。 miR390和ARF2/3/4之间的正负反馈环路定义了miR390的正确定位，并进一步调节了侧根的发育。 miR160靶向 ARF10 和 ARF16 并在根冠形成过程中发挥调节功能。另外，在胁迫条件下，miR393被诱导并切割生长素受体 TIR1 和 AFB2 的转录本，从而影响侧根的发育。

 miRNA也参与与土壤环境的根部共生。在藜苜蓿中，miR169通过将 HAP2-1 （CCAAT结合家族的转录因子）的表达限制在结节区域来影响结节细胞的分化。 miR319d-TCP在大豆和根瘤菌之间的固氮过程中发挥作用。在大豆中，miR393调节植物生长素信号传导中的 GmTIR1 和 GmAFB3 ，该调节对于确定结节发育至关重要。有趣的是，过表达miR390促进侧根生长，但抑制结节形成，表明miR390- ARF 模块在这些发育过程中具有相反的功能

miRNA-mediated regulation of seed development

在一部分陆地植物中，种子是施肥的产物。在种子产生，成熟和萌发过程中起作用的miRNA包括miR159，miR160，miR165 / 166，miR395，miR402和miR417 。在拟南芥中，针对MYB33/65的miR159a/b调控种子的大小和形态。 miR172-AP2还参与确定种子大小，重量以及油和蛋白质含量。在拟南芥和番茄中，miR167-ARF6/8途径似乎可以调节种子的分散和花器官的发育。miR160的靶标ARF10会影响种子发育，因为该基因的沉默会导致扭曲的种子角果。拟南芥miR165/166的丧失导致种子萌发和幼苗早期对ABA的超敏反应。在甘蓝型油菜中，由于无机磷酸盐/铜不足，miR2111，miR399，miR827和miR408的表达增加限制了角果的生长。

在水稻中，miR156调控 SPL 基因会影响籽粒大小和穗分枝。具体而言，OsSPL13正向地调节晶粒长度和晶粒厚度，而OsSPL16负向地调节晶粒长度，但正向地调节晶粒宽度。miR396和miR397分别靶向 OsGRF4 和 OsLAC 来调节颗粒大小。就谷物品质而言，过表达osa-miR5144导致其靶基因 OsPDIL1; 1 的水平降低，这是蛋白质二硫键含量调节和谷物中散装淀粉颗粒形成的关键催化剂。

对过表达miR393和靶标模拟研究表明，它通过靶向两种TIR1 / AFB生长素受体来发挥其在大麦种子发育中的作用。 此外，发育和萌芽的大麦种子的胚胎中富含miRNA，例如miR156，miR168，miR166，miR167和miR894，以及大麦特异性miR5071，它们可能通过靶向作用参与防御反应。 类似OsMLA10的基因。 因此，这些miRNA在胚胎发育过程中可能具有重要的调控作用。

受一作者启发，找到了这本《Plant Small RNA》，并阅读其中内容巩固知识，发布出来为了在疫情这段放假时间督促自己学习，如有批评指正，不胜感激～

真核细胞中核酸存在于什么部位

核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动。生物体内还有相当数量以游离形式存在的核苷酸。

核酸是DNA和RNA的统称

DNA主要分布在细胞核中，部分分布线粒体和叶绿体中。

RNA主要分布在核糖体中，部分分布在细胞核、叶绿体、线粒体中，少量分布在细胞质、甚至内质网和叶泡中。

总之，几乎细胞中处处有核酸。

循环miRNA

循环DNA

外泌体

在几乎所有的体液中，包括尿液、血液、乳汁等，都存在游离的核酸。血液中存在游离的小RNA，部分在外泌体中，部分不在外泌体中。无论在不在外泌体之中，这些小RNA都在调节生理稳态过程中发挥了很重要的作用。

circRNA研究应用专篇①：“sponge”与“biomarker”

circRNAs（Circular RNAs，环状RNA分子）是一类不具有5'末端帽子和3'末端 poly(A) 尾巴、并以共价键形成闭合环形结构的非编码RNA分子，在真核生物中广泛存在。近年来，circRNA 基金情况呈现增长趋势，在2020年基金额达到3000万+（数据摘自：Let Pub），研究热度可见。

circleRNA 的研究为何如此火热？它们在生物体的生长发育过程中、生理生化反应中凭借其独特的结构发挥着怎样的作用？别急，circleRNA 研究应用之上篇——sponge+biomarker，我为您倾情奉上，祝您科研一臂之力！

1、miRNA 分子海绵（sponge）

circRNA 含有大量的 miRNA 结合位点，具有 miRNA 海绵作用，进而间接调控 miRNA 下游靶基因的表达。

2、生物标志物（biomarker）

circRNA结构稳定、半衰期长，可在组织和发育阶段特异性表达，circRNA不仅存在于组织和细胞中，而且在体液中也有大量存在，可作为生物标志物。

作用机制：miRNA 海绵

背景：化疗耐药是三阴性乳腺癌（TNBC）临床治疗失败和预后不良的主要原因。 circRNA 在TNBC 化疗耐药性方面的研究尚为空白。

研究结论： CircWAC / miR-142 / WWP1形成竞争性内源RNA（ceRNA）网络，CircWAC通过靶向结合miR-142，上调WWP1并激活TNBC细胞中的PI3K / AKT信号传导活性进而诱导三阴性乳腺癌的化疗耐药性。

作用机制：miRNA 海绵

背景：CircRNA 的异常表达会导致人类疾病。circRNA 通过特定的 microRNA 来调节基因表达。本研究探讨 circMAP3K5（环状有丝分裂原激活的蛋白激酶5）是否可以充当竞争性结合内源性 microRNA-22-3p（miR-22-3p）海绵并调节新内膜增生。

研究思路：

研究结论：研究确定 circMAP3K5 为 TET2 介导的血管 SMC 分化的主要调控因子。靶向 circMAP3K5 / miR-22-3p / TET2 途径可能为与内膜增生相关的疾病（包括再动脉粥样硬化）提供潜在的治疗策略。

作用机制：biomarker

背景：目前，血液生物标记物已经被广泛用于癌症诊断，但低敏感性和特异性限制了它们在普通人群癌症筛查中的广泛应用。目前，研究者正致力于通过微创技术（即液体活检）获得新型、高精度的人体体液生物标志物。近年来，快速发展的高通量转录组分析技术已证实许多 circRNA 稳定存在于诸多体液中，包括血浆、血清、外泌体和尿液等。

研究思路：

研究结果：多种肿瘤研究结果证实，circRNA 可作为液体活检的重要分子标志物，作者还使用R中的 shinys 包开发了一个新的、直观的 web 界面，供用户探索和分析 circRNA。

作用机制：biomarker

研究背景：

胃癌是世界上最常见的癌症之一。由于缺乏特异性症状，80%以上的患者确诊时已是晚期，死亡率高，因此早期胃癌诊断势在必行。

研究思路

研究结论：

circPTPN22 可以作为一种有效的胃癌诊断和预后生物标志物，circPTPN22 表达下调，可通过影响EMT途径抑制胃癌细胞的增殖和转移，该研究成果提示，circPEPN22 可能通过 ceRNA 机制影响胃癌的进展。

参考文献：

1、 Wang L , Zhou Y , Jiang L , et al. CircWAC induces chemotherapeutic resistance in triple-negative breast cancer by targeting miR-142, upregulating WWP1 and activating the PI3K/AKT pathway[J]. Molecular Cancer, 2021, 20(1).

2、Zeng Z , Xia L , Fan S , et al. Circular RNA CircMAP3K5 Acts as a MicroRNA-22-3p Sponge to Promote Resolution of Intimal Hyperplasia via TET2-Mediated SMC Differentiation[J]. Circulation, 2021, 143(4).

3、Wang S , Zhang K , Tan S , et al. Circular RNAs in body fluids as cancer biomarkers: the new frontier of liquid biopsies[J]. Molecular Cancer, 2021, 20(1).

4、Ma S , Kong S , Gu X , et al. As a biomarker for gastric cancer, circPTPN22 regulates the progression of gastric cancer through the EMT pathway[J]. Cancer Cell International, 2021, 21(1).