细胞间接免疫荧光步骤（间接免疫荧光法）

本文目录一览：

• 1、非洲猪瘟检测方法是什么？
• 2、细胞生物学
• 3、非洲猪瘟的检测方法有哪些?非洲猪瘟疫情防控方法是什么？
• 4、免疫荧光 定位
• 5、常用的细胞染色方法有哪些
• 6、Hoechst 33342 染色的原理？

非洲猪瘟检测方法是什么？

1、红细胞吸附试验：将健康猪的白细胞加上非洲猪瘟猪的血液或组织提取物，37℃培养，如见许多红细胞吸附在白细胞上，形成玫瑰花状或桑椹体状，则为阳性。

2、直接免疫荧光试验：荧光显微镜下观察，如见细胞浆内有明亮荧光团，则为阳性。

3、动物接种试验。

4、间接免疫荧光试验：将非洲猪瘟病毒接种在长满Vero细胞的盖玻片上，并准备未接种病毒的Vero细胞对照。试验后，对照正常，待检样品在细胞浆内出现明亮的荧光团核荧光细点可被判定为阳性。

5、酶联免疫吸附试验：对照成立时（阳性血清对照吸收值大于0.3，阴性血清吸收值小于0.1），待检样品的吸收值大于0.3时，判定为阳性。

6、免疫电泳试验：抗原于待检血清间出现白色沉淀线者可判定为阳性。

7、间接酶联免疫蚀斑试验：肉眼观察，或显微镜下观察，蚀斑呈棕色则为阳性，无色则为阴性。

扩展资料

非洲猪瘟急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。

在无本病的国家和地区应防止ASFV的传入，在国际机场和港口，从飞机和船舶来的食物废料均应焚毁。对无本病地区事先建立快速诊断方法和制定一旦发生本病时的扑灭计划。

参考资料来源：百度百科-非洲猪瘟病毒

参考资料来源：百度百科-非洲猪瘟

细胞生物学

细胞的基本共性：1，相似的化学组成，各细胞的基本构成元素都是C, H, O, N, P,S,等几种，这些元素所形成的氨基酸，核苷酸，脂质和糖类是构成细胞的基本构件。

                                2，脂-蛋白体系的生物膜

                                3，相同的遗传装置

                                4，一分为二的分裂方式

整个生物界最基本的类群包括3个域：原核生物界，古核生物界，真核生物界。

与真核细胞相比，原核细胞的基因组很小，仅为10^6~10^7 bp，大部分原核细胞的主要遗传物质仅为一个环装DNA。

最小最简单的细胞--支原体，支原体能寄生于细胞内繁殖，因此是细胞培养中常见又难以去除的污染源。

革兰氏阳性和阴性菌细胞壁如下图

青霉素的抑菌作用主要通过抑制肽聚糖的合成，从而抑制细胞壁的形成阳性菌因此对青霉素敏感，反之，阴性菌因肽聚糖含量极少，对青霉素不敏感。

细菌细胞质膜：选择性交换物质，细胞质膜内侧含有电子传递与氧化磷酸化的酶系，可以进行有氧呼吸，细胞质膜内侧含有一些酶，与核糖体共同执行合成向外分泌蛋白质的功能。细胞质膜还含有细胞色谱酶与合成细胞壁成分的酶。因此，细胞质膜可以完成内质网，高尔基体和线粒体所承担的大部分工作。此外，细菌细胞膜外侧有受体蛋白，参与细菌对周围环境的应答反应。

中膜体又称间体或质膜体，由细胞膜内陷形成的囊泡状，管状，包层状膜结构，每个细胞内有一个或数个中膜体，其功能尚不明确。

人们延用了真核细胞的染色体概念，也把细菌的核区DNA称为染色体，实际上它没有真正的染色体结构。

细菌细胞核外DNA，细菌细胞中，除核区DNA外，还存在可自主复制的质粒。

细菌细胞的核糖体：核糖体充满于细胞中，少部分附着在细胞膜内侧，合成运输到胞外的蛋白。

细菌细胞内生孢子：很多革兰氏阳性菌处于不利环境或耗尽营养时，容易形成内生孢子，又称芽孢，是对不良环境有抵抗力的休眠体。

细菌细胞的增殖及其调控：DnaA蛋白是复制起点(OriC)的结合蛋白，大约10个DnaA蛋白携带ATP结合于OriC, ATP 水解促使此处富含AT碱基对的区域解链，开启DNA复制。

古细菌又称古核生物，常发现于极端特殊环境。

一，生物膜系统

二，遗传信息传递与表达调控

核小体盘绕与折叠成紧密程度不同的常染色质与异染色质，细胞分裂阶段又进一步包装成染色体。核仁主要是转录rRNA与核糖体亚单位装配的场所。

三，细胞骨架系统

细胞骨架系统是由一系列特异的结构蛋白装配而成的网架系统，对细胞形态与内部结构的合理排布起支架作用。细胞骨架可分为胞质骨架与核骨架。胞质骨架主要由微丝，微管与中等纤维等构成。

核骨架包括核纤层( nuclear lamina)与核基质( nuclear matrix)。核纤层的成分是核纤层蛋白，核基质的成分比较复杂。它们与基因表达，染色质构建与排布有关。

细胞的大小及其影响因素：

细胞的尺寸取决于核糖体的活性，因为蛋白质的量由核糖体来决定。

从果蝇到哺乳动物的各种生物，都有一套几乎完全相同的信号网络来调控细胞的大小。哺乳动物中这一网络的中心叫mTOR              ( mammalian target of rapamycin)的蛋白激酶，因其能被雷帕霉素( rapamycin)抑制而得名，果蝇等生物中也存在同源蛋白质TOR。在小鼠或果蝇中，该蛋白质的失活会导致细胞体积变小。

细胞外部氨基酸，葡萄糖等营养物质，以及胰岛素等生长因子—活化—mTOR(或TOR)

活化的mTOR有两个功能：活化核糖体蛋白S6( rpS6)的激酶( S6K)，导致rpS6磷酸化，从而可能加强核糖体的翻译效率，因而使细胞增大。活化的mTOR将翻译抑制因子    4E-BP 磷酸化，解除其对翻译起始因子4E的抑制。增强蛋白质的翻译，促使蛋白质积累。

细胞大小的决定是复杂的，还受到其他多种因素的影响。如DNA含量越大，核糖体越多，因而翻译的蛋白质越多，细胞就越大。

原核细胞与真核细胞的比较：

植物细胞与动物细胞的比较：

植物细胞特有结构：细胞壁，液泡，叶绿体。

非细胞生物——病毒：

病毒很小

遗传载体多样性

彻底的寄生性

病毒以复制和装配的方式进行增殖

病毒在细胞内繁殖：

病毒识别和入侵细胞，病毒表面蛋白质与细胞表面特异受体相互作用，病毒与细胞发生特异性的吸附。动物病毒进入细胞的方式有两种：一是细胞以主动胞饮的方式使病毒进入，二是某些有囊膜的病毒，通过其囊膜与细胞质膜融合呃呃呃方式进入细胞，如HIV，或通过胞饮进入细胞，然后与胞饮囊泡的膜融合进入细胞质中。噬菌体侵染细菌时仅将其核酸注入细胞。植物病毒难以穿越坚韧的细胞壁，常常借住于昆虫进食过程侵染植物细胞。

细胞生物学研究方法

研究特异DNA，RNA片段或蛋白质所常用的Southern杂交，Northern杂交和蛋白免疫印迹等。

光学显微镜：

普通复式光学显微镜，相差显微镜和微分干涉显微镜，荧光显微镜，激光扫描共焦显微镜

电子显微镜：

电镜制样技术：超薄切片技术，负染色技术，冷冻蚀刻技术，电镜三维重构与低温电镜技术。

扫描隧道显微镜

细胞及其组分的分析方法：

超离心技术分离细胞组分：密度剃度离心是将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的，高溶解性的惰性物质(如蔗糖)形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降。各组分的沉降率与它们的大小形状有关，通常以沉降系数表示。

速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。

等密度沉降用于分离不同密度的细胞组分。

细胞成分的细胞化学显示方法：                            为了测定蛋白质，核酸，多糖和脂质等细胞组分通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊集团特异性结合的特征。

福尔根反应可以特异显示呈紫红色的DNA的分布。其原理是：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并去除DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤。使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。

PAS反应则利用过碘酸氧化作用生成醛基，醛基与碱性品红反应产生紫红色化合物，用于确定多糖的存在。

四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂滴的存在。苏丹Ⅲ(深红色)染色则通过扩散进入脂滴中，使脂滴着色。

蛋白质检测方法：米伦反应，氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀。重氮反应中，氢氧化重氮与酪氨酸，色氨酸和组氨酸起反应形成有色复合物。蛋白质中的-SH基可用形成硫醇盐共价键的试剂进行检测。

由于大多数固定剂对酶都有失活或钝化作用，所以，在进行细胞中某种酶的定性研究时，样品制备常采用冰冻切片，或以冷丙酮，甲醛进行短时间固定，以尽量保持酶的活性。

特异蛋白抗原的定位与定性：

免疫荧光与免疫电镜是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术。对蛋白质组分进行体外分析定性通常采用免疫印迹，放射免疫沉淀和蛋白质芯片，质谱分析等技术。

1，免疫荧光技术就是将免疫学方法(抗原-抗体特异结合)与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。包括直接和间接免疫荧光技术两种。

2，免疫电镜技术：

免疫电镜技术可分为免疫铁蛋白技术，免疫酶标技术与免疫胶体金技术，其主要区别是与抗体结合的标志物不同。

细胞内特异核酸的定位与定性：

细胞内特异核酸( DNA或RNA)的定性与定位的研究，通常采用原位杂交技术。用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中位置的方法称为原位杂交。

定量细胞化学分析与细胞分选技术：

流式细胞术可定量地测定某一细胞中的DNA，RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至可用于细胞的分选。

细胞培养与细胞工程：

动物细胞培养，原代培养细胞一般传至10代左右就传不下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡。极少数细胞度过危机，又可传代40~50代次，传至50代以后又出现危机。

植物细胞培养：单倍体细胞培养，用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子(雄性生殖细胞)直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株。或者通过愈伤组织诱导分化。

原生质体培养，一般用植物的体细胞，先用纤维素酶处理去掉细胞壁，去壁的细胞称为原生质体。原生质体可以在无菌培养基中生长分裂。

细胞融合与单克隆抗体技术：

两个或多个细胞融合为一个双核或者多核细胞的现象称为细胞融合。介导动物细胞融合常用的促融剂有灭活的病毒或化学物质(如聚乙二醇，PEG);植物细胞融合时，要先用纤维素去掉细胞壁，然后才便于原生质体融合。20世纪80年代又挡发明了电融合技术(electronfusion method)。将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群，或对相互接触的单层培养细胞，再施加高压电脉冲处理使其融合。

基因型相同的细胞融合称为同核体，基因型不同的融合后称为异核体。

B淋巴细胞杂交瘤技术用于制备单克隆抗体(monoclonal antibody)

制备过程：将小鼠骨髓瘤细胞与经绵阳红细胞免疫过的小鼠脾细胞( B淋巴细胞)在聚乙二醇或灭活的病毒介导下发生融合。由于骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT,在含氨基蝶呤的培养液内不能成活。只有融合细胞才能在HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)的培养液内通过旁路合成核酸而得以生存。通过HAT选择培养和细胞克隆，可以获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了探明核质相互作用的机制，科学家们创建了细胞拆合技术。所谓细胞拆合技术就是把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体(cytoplast)和核体( karyoplast)相互组合，形成核质杂交细胞。

细胞拆合可以分为物理法和化学法两种类型。物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。化学法是用细胞松弛B (cytochalasin B)处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体和胞质体两部分。显微操作技术是在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和向核内注入基因。

荧光漂白恢复技术(fluorescence photobleaching recovery, FPR)技术是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素，绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质藕联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率。FPR技术的原理是：利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，这一区域称光漂白( photobleaching)区。随后，由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区的荧光强度逐渐恢复到原有水平。这一过程称为荧光恢复。荧光恢复的速度在很大程度上反映荧光标记蛋白或脂质在细胞中运动速率。

单分子技术与细胞生命活动的研究：

与生命科学相关的单分子技术是在细胞内实时观测单一生物分子运动规律的技术。

酵母双杂交技术：

酵母双杂交技术( yeast two-hybrid system)是一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统。细胞基因转录起始需要转录激活因子的参与，转录激活因子一般由两个或两个以上相互独立的结构域构成，即DNA结合域( DNA binding domain, DB)和转录激活域( activation domain, AD)。前者可以识别DNA上特异转录调控序列并与之结合；后者可与其他成分作用形成转录复合体，从而启动它所调节基因的转录。如果要证明蛋白A是否与蛋白B在细胞内相互作用，则可分别制备DB与蛋白A的融合蛋白(又称"诱饵"，bait)，以及AD与蛋白B的融合蛋白(又称猎物，prey)。如果蛋白A与蛋白B在细胞内相互结合，则可形成与转录激活因子类似的具有DB和AD结构域的复合物，从而启动报告基因的表达。反之，则报告基因不表达。

荧光共振能量转移技术:

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技术是用来检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用的重要手段。其基本原理是：在一定波长的激发光照射下，只有携带发光集团A的供体分子可被激发出波长为A的荧光，而同一激发光不能激发携带发光集团B的受体分子发出波长为B的荧光。然而，当供体所发出的荧光光谱A与受体上的发光集团的吸收光谱相互重叠，并且两个发光集团之间距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移，即受体分子的发光集团吸收了供体所发出的荧光，结果受体分子放出了波长为B的荧光，这种现象称为FRET现象。如下图：

如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，就可能发生FRET现象，由此认为这两个蛋白质存在着直接的相互作用。

放射自显影技术：

利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性，定位与半定量研究的一种细胞化学技术。对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪(pulse-chase)是这一技术独具的特征。放射自显影技术包括两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。

生物信息学( bioinformatics)

细胞生物学常用模式生物：大肠杆菌，酵母，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠，拟南芥

突变体制备：DNA和RNA两个水平制备，从RNA水平主要是RNA干扰技术。RNAi技术是指利用一段特异的双链RNA或单链反义RNA通过注射，转染或转基因的方法导入到细胞或模式生物体中，这样的RNA可以启动一套信号通路来最终降解与这段RNA对应的，通常是包含这段序列的mRNA，使该mRNA无法翻译成相关的蛋白质。

基因敲除(knock out)是在DNA水平制备突变体的一种方法。通常DNA水平突变体的制备方法有三种(以果蝇为例)：化学诱变法(给果蝇喂食化学诱变剂，造成随机的点突变或者DNA片段丢失)，P因子介导的突变(利用转座子的转座特性及转座子的移动过程中可以带走部分基因组DNA序列的特性)和基于同源重组的定点突变。

蛋白质组学技术：

1，双向凝胶电泳

双相凝胶电泳的第一相是等电聚焦( IEF)电泳，采用pH梯度，根据蛋白质等电点不同进行分离。第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)，根据蛋白质相对分子质量大小进行分离。

2，色谱技术

3，质谱

4，蛋白质芯片

5，生物信息学

细胞质膜(plasma membrane)曾称细胞膜( cell membrane)。真核细胞，细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜

流动镶嵌模型主要强调：1，膜的流动性 2，膜蛋白分布的不对称性，有的分布于膜表面 ，有的嵌入或横跨脂双分子层。

近些年提出的脂筏模型 ( lipid raft model)是对膜流动性的新的理解。该模型认为甘油磷脂为主体的生物膜上，胆固醇，鞘磷脂等富集区域形成相对有序的脂相，如同漂浮在脂双层上的"脂筏"一样载着执行某些特定生物学功能的各种膜蛋白。脂筏最初可能是在高尔基体上形成，最终转移到细胞质膜上。有些脂筏可以在不同程度上与膜下细胞骨架蛋白交联。据推测，一个直径100nm的脂筏可载有600个蛋白质分子

目前对生物膜结构的认识可归纳如下：

1，具有极性头部和非极性尾部的磷脂分子在水相中具有自发形成封闭的膜系统的性质，磷脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝水相形成脂双分子层，每层磷脂分子称为一层小叶( leaflet)。

2，蛋白质分子以不同的方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，蛋白质的类型，蛋白质分布的不对称性及其与脂分子的协同作用赋予生物膜各自的特性与功能。

3，生物膜可看成是蛋白质在双层脂分子中的二维溶液。然而膜蛋白与膜脂之间，膜蛋白与膜蛋白之间及其与膜两侧其他生物大分子的复杂的相互作用，在不同程度上限制了膜蛋白和膜脂的流动性。同时也形成了赖以完成多种膜功能的脂筏，纤毛和微绒毛等结构。

4，在细胞生长和分裂等整个生命活动中，生物膜在三维空间上可出现弯曲，折叠，延伸等改变，处于不断地动态变化中。从而保证了诸如细胞运动，细胞增殖等代谢活动的进行。

膜脂：主要包括甘油磷脂(glycerophosphatide),鞘脂(sphingolipid)和固醇( sterol)三种基本类型。生物膜上还有少量的糖脂( glycolipid),鉴于绝大多数的糖脂都属于鞘氨醇的衍生物，因此，目前人们多将糖脂归于鞘脂质。

1，甘油磷脂

甘油磷脂构成了脂膜的基本成分，占整个脂膜的50%以上。甘油磷脂为3-磷酸甘油的衍生物，包括磷脂酰胆碱(卵磷脂，phosphatidylserine , PS),磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)和磷脂酰肌醇( phosphatidylinositol, PI)等，主要在内质网上合成。组成生物膜的甘油磷脂分子主要特征是：1，具有一个与磷酸基团相结合的极性头和两个非极性的尾(脂肪酸链)，但存在于线粒体内膜和某些细菌脂膜上的心磷脂除外，它具有4个非极性的尾部。2，脂肪酸碳链为偶数，多数碳链由16或18个碳原子组成。3，除饱和脂肪酸外，常常还含有1~2个双键的不饱和脂肪酸。

2，鞘脂

3，固醇

胆固醇及其类似物统称为固醇，它是一类含有4个闭环的碳氢化合物，其亲水的头部为一个羟基，是一种分子刚性很强的两性化合物。

膜蛋白：

根据膜蛋白分离的难易程度及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为3种基本类型：外在膜蛋白(extrinsic membrane protein)或称外周膜蛋白(peripheral membrane protein)，内在膜蛋白或称整合膜蛋白(intergral membrane protein)，脂锚定膜蛋白( lipid anchored protein)。

外在膜蛋白为水溶性蛋白质，靠离子键或其他较弱的键与膜表面的膜蛋白分子或膜脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，但膜结构并不被破坏。磷脂酶就是其中一例。它也是蛇毒的活性成分。

脂锚定膜蛋白是通过与之共价相连的脂分子(脂肪酸或糖脂)插入膜的脂双分子中，而锚定在细胞质膜上，其水溶性的蛋白质部分位于脂双层外。

内在膜蛋白与膜结合比较紧密，只有用去垢剂处理使膜崩解后才可分离出来。内在膜蛋白占整个膜蛋白的70%~80%，据估计人类基因中，1/4~1/3基因编码的蛋白质为内在膜蛋白。

内在膜蛋白与膜脂结合的方式：

目前所了解的内在膜蛋白均为跨膜蛋白，跨膜蛋白在结构上可分为：胞质外结构域，跨膜结构域和胞质内结构域等3个组成部分。它与膜结合的主要方式有：

1，膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心相互作用，这是内在膜蛋白与膜脂结合的最主要和最基本的结合方式。

2，跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基，如精氨酸，赖氨酸等与磷脂分子带负电的极性头部形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过Ca2+，Mg2+等阳离子与带负电的磷脂极性头部相互作用。

3，某些膜蛋白通过自身在胞质一侧的半胱氨酸残基共价结合到脂肪酸分子上，后者插入脂双层中进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力。

去垢剂( detergent)是一端亲水，一段疏水的两性小分子，是分离与研究膜蛋白的常用试剂。去垢剂可以插入膜脂，与膜脂或膜蛋白的跨膜结构域等疏水部位结合，形成可溶性的颗粒。去垢剂分为离子型去垢剂和非离子型去垢剂两种类型。常用的离子型去垢剂如十二烷基硫酸钠( SDS)具有带电荷的基团，其分子式如下：

SDS可使细胞膜崩解，与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离，高浓度的SDS还可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，甚至改变蛋白质亲水部分的构象。这一特性常用于蛋白质成分分析的SDS凝胶电泳。由于SDS对蛋白质的作用较为剧烈，可引起蛋白质变性，因此在纯化膜蛋白时，特别是为获得有生物活性膜蛋白时，常常采用不带电荷的非离子去垢剂。

常用的非离子去垢剂Triton X-100分子式如下：

非离子去垢剂也可使细胞膜崩解，但对蛋白质的作用比较温和，它不仅用于膜蛋白的分离纯化，也用于除去细胞的膜系统，以便对细胞骨架蛋白和其他蛋白质进行研究。

膜脂的流动性主要指脂分子的侧向运动，它在很大程度上是由脂分子本身的性质决定的，一般来说，脂肪酸链越短，不饱和程度越高，膜脂的流动性越大(猜想植物油和动物油，手动滑稽)

膜蛋白的流动性

膜脂和膜蛋白运动速率的检测

荧光漂白恢复技术( FPR)是研究膜蛋白或膜脂流动性的基本实验技术之一。

膜脂和膜蛋白在生物膜上呈不对称分布，糖蛋白和糖脂的糖基部分均位于细胞质膜的外侧。

为了便于研究个了解细胞质膜以及其他生物膜的不对称性，人们将细胞质的各个膜面命名如下：与细胞外环境接触的膜面称质膜的细胞外表面(extrocytoplasmic surface, ES)，这一层脂分子和膜蛋白称细胞膜的外小叶( out leaf),与细胞质基质接触的膜面称质膜的原生质表面(protoplasmic surface, PS)。

膜蛋白的不对称性

细胞质膜相关的膜骨架

细胞质膜特别是膜蛋白常常与膜下结构(主要是细胞骨架系统)相互联系，协同作用，并形成细胞表面的某些特化结构以完成特定的功能。这些特化结构包括膜骨架( membrane associated cytoskeleton)，鞭毛和纤毛，微绒毛及细胞的变形足等，分别与细胞形态的维持，细胞运动，细胞的物质交换和信息传递等功能有关。

膜骨架：膜骨架是指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构，它从力学上参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。

红细胞质膜蛋白及膜骨架

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析血影的蛋白质成分显示：红细胞膜蛋白主要包括血影蛋白或称血膜肽(spectrin),锚蛋白( ankyrin),带3蛋白，带4.1蛋白，带4.2蛋白和肌动蛋白( actin)，此外还有一些血型糖蛋白(glycoprotein)。

膜骨架蛋白主要成分包括血影蛋白，肌动蛋白，锚蛋白和带4.1蛋白等。

细胞质膜的基本功能

1，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境

2，选择性的物质运输

3，提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传导

4，为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行

5，介导细胞与细胞，细胞与胞外基质之间的连接

6，质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构

7，膜蛋白的异常与某些遗传病，恶性肿瘤，自身免疫病甚至神经退行性疾病相关，很多膜蛋白可作为疾病治疗的药物靶标。

非洲猪瘟的检测方法有哪些?非洲猪瘟疫情防控方法是什么？

荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。　

等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。

要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。

非洲猪瘟防控注意事项

养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。

殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。

免疫荧光 定位

你所说的方法是采用荧光素分子直接标记抗体，在免疫荧光中被称为直接法。

更多的做法不是采用直接法而是采用间接法，也就是用对应某一种抗原的抗体（这里被称为一抗）与细胞孵育结合，在采用对应一抗（也就是抗一抗）的抗体（这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子）与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察。

间接法较直接法能够有效降低背景荧光，提高信噪比，同时由于抗体的放大效应使得检测灵敏度大大提升。

我就在做这方面的研究工作，如果需要的话可以共同探讨。

举例：对细胞微管蛋白进行亚细胞定位，，用低聚甲醛固定细胞，NP-40穿孔，选择抗微管蛋白的抗体作为一抗，孵育后洗脱去背景，加入偶联荧光素的二抗孵育后洗脱去背景，，上荧光显微镜观察。

希望能够对你有所帮助。

常用的细胞染色方法有哪些

常用的细胞染色方法有：

1、简单染色法，常用碱性染料如美蓝等进行简单染色；

2、革兰氏染色法，主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程；

3、瑞氏染色法，瑞氏染料溶剂主要是由伊红美蓝组成；

4、吉姆萨染色法，吉姆萨染色原理与结果和瑞特染色法基本相同；

5、细胞免疫荧光染色法，免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合。

染色是生物显微玻片标本制作中最重要的环节之一。先把破坏细胞膜的选择透过性，再使用染色剂，将生物组织浸入染色剂内，使组织细胞的某一部分染上与其他部分不同的颜色或深度不同的颜色，产生不同的折射率，以便观察。

另外，银染法也较常用。当组织块浸入硝酸银溶液中时，有的组织结构能直接把硝酸银还原，使银粒附于其上，呈棕黑色或棕黄色。有些结构本身对硝酸银无直接还原能力，若加入还原剂，可使硝酸银还原沉淀显色。

扩展资料：

染色细胞固定有物理法与化学法，物理法为干燥和火焰固定，化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。

1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。

2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。

3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。

4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。

5、金属沉着法：其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。

参考资料：百度百科——瑞氏染色法

参考资料：百度百科——革兰氏染色法

参考资料：百度百科——吉姆萨染色

Hoechst 33342 染色的原理？

�0�1 Hoechst 33342，也称bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式为C27H28N6O�6�13HCl�6�13H2O，分子量为615.99，CAS Number 23491-52-3。

�0�1 Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。

�0�1 Hoechst 33342染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

�0�1 Hoechst 33342的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。

�0�1 Hoechst 33342溶于水，溶解度可达20mg/ml。

�0�1 用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33342工作浓度为0.5-10微克/毫升。

荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。而PI染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

使用说明：

1.对于固定的细胞或组织：

a.对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33342染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33342染色。

b.对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。

c.吸除Hoechst 33342染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。

d.直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

2.对于活细胞或组织：

a.加入适当量Hoechst 33342染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。

b.在适宜于细胞培养的温度培养20-30分钟。弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。