外泌体的marker（外泌体的价格）

本文目录一览：

• 1、外泌体是做什么的？
• 2、【文献分享】植物分泌小RNA来沉默真菌的毒性基因
• 3、外泌体细胞保存液是做什么的？
• 4、液相进样瓶能放在-80冰箱吗
• 5、外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论
• 6、外泌体对护肤的作用是什么？

外泌体是做什么的？

外泌体（Exosomes）是一种双磷脂膜囊泡，含有蛋白、脂质及核酸等多种成分，是细胞外囊泡的一种。外泌体体积小，直径在40～200 nm,在透射电镜下具有典型的杯状结构。几乎所有的细胞都分泌外泌体，外泌体在细胞间的连接中发挥重要作用。

01、外泌体的形成

细胞发生内吞后，内陷的细胞膜形成数个小囊泡，小囊泡相互融合形成了早期内体（early endosome），逐渐成熟的早期内体膜多处凹陷并向内出芽形成含管腔状囊泡（intraluminal vesicle,ILVs）的晚期内体（late endosome）；富含ILVs的内体称为多囊体（multivesicular body,MVBs）。MVBs有两个去向：一部分MVBs与溶酶体融合，以降解其内容物；另一部分MVBs与细胞膜融合，释放ILVs到细胞外，这些分泌的ILVs即为外泌体。

02、外泌体的功能

外泌体是一种细胞连接物，能够输送蛋白、脂质及核酸到靶细胞，可以在血管形成、抗原呈递、炎症反应和细胞增殖及分化等各种生物过程中发挥功能。

外泌体可以通过两种途径影响受体细胞，其一，外泌体和受体细胞间的配体-受体相互作用，无需将外泌体或其内容物内化到靶细胞。其二，外泌体通过膜融合或内吞作用进入细胞，其成分被摄取后释放到细胞质中，通过调节特定的基因表达和信号通路影响宿主细胞，最终导致细胞功能或表型的改变。

【文献分享】植物分泌小RNA来沉默真菌的毒性基因

写在前面

    本次分享一篇2020年由金海翎老师发表在 Science 上的paper “Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes” 。主要讲了植物在面临真菌病害灰霉病时，会通过外泌体途径分泌小RNA来靶向灰霉病菌的毒性基因来抵抗病原菌的入侵。文章结论让人通俗易懂(可能哺乳系统中人们已经接受了这种现象)，新意主要在于思路和采取的技术方面，

Abstract

    病原菌和害虫会传递小RNA来抑制宿主免疫反应。与之对应的是，宿主会分泌小RNA到病原菌中来抑制其毒性，而目前对于宿主的小RNA是如何转运的还未知。作者展示了拟南芥通过外泌体途径分泌囊泡裹挟小RNA到灰霉病菌中，囊泡在侵染点积累并且被病菌占据，沉默了灰霉病菌中的毒性基因。

    在动物体内，sRNAs可以通过细胞外囊泡、特异跨膜蛋白、高密度脂蛋白复合物或缝隙连接运输。植物中，sRNAs可能通过胞间连丝和维管系统。但是植物中，sRNAs在植物与病原菌互作中是如何传递的还是个未知的问题。

    为了查明宿主sRNAs如果向病原菌中传递，并且鉴定植物内源的sRNAs，作者采用拟南芥-灰霉病菌系统来展示跨界sRNAs运输。因为植物和真菌的细胞壁成分不同，他们采用连续的原生质体纯化体系来从侵染部位分离真菌细胞。

    通过对灰霉菌原生质体的sRNAs测序得到42个拟南芥的sRNAs，使用叶片的总sRNAs作为对照。在这42个sRNAs中，有25个是低丰度的，并不在总sRNAs的top100中，展示出sRNAs运输的选择性。这些结果通过sRNAs的RT-PCR得到验证(F1A)。这就暗示，传递sRNAs到真菌细胞中并不是简单通过剂量效应，可能有个选择性的过程。

    动物中，胞外囊泡介导了运输过程。我们从侵染叶片的质外体空间分离了sRNAs，结果发现，TAS1c-siR483, TAS2-siR453, 和 IGN-siR1 比TAS1c-siR585, TAS2-siR710,

和 IGN-siR107积累水平要高(F1B)，这与真菌原生质体的结果是相似的。42个传递的sRNAs中，有31个出现在囊泡库中。核酸酶保护试验发现，传递的sRNAs被囊泡保护免受核酸酶降解，除非囊泡被Triton-X100破坏(F1C)。这就说明sRNAs被囊泡包裹运输，而不是裸漏在表面。

    动物细胞外囊泡根据其特定的蛋白标记物和来源可分为外泌体、脱落微囊泡和凋亡小体，并且动物细胞能通过外泌体完成和其寄生菌的相互转运，因此作者就首先尝试外泌体途径。动物中外泌体的marker基因为四分子交联体家族成员，如CD63，植物中的TET8和TET9在灰霉病侵染时被诱导表达，TET8和TET9与CD63展示出结构相似性。

    TET8在真菌侵染点积累(F2A)，动物细胞中外泌体来自于多泡小体(MVBs)，拟南芥中MVB marker是ARA6(GTPase)。ARA6也在侵染点富集，揭示TET8联系的 囊泡来自于ARA6。投射电镜下观察，MVBs整合细胞膜在侵染点释放囊泡(F2B)。ARA6-GFP和TET8-GFP在侵染点的囊泡聚集发现，后者有更多的囊泡分泌，因此TET8标记的胞外囊泡作为植物的外泌体。

体外分离侵染TET8-GFP的灰霉病菌，TET8-GFP能在真菌细胞中检测的到，使用Triton-X100处理后也能检测的到(F2C)。这就说明真菌细胞会被植物外泌体所占据，并且也能检测到外泌体携带的sRNAs(F2D)。这也就说明植物分泌携带sRNAs的外泌体到真菌细胞中。

    TET8-CFP和TET9-YFP在侵染点共定位(F3A)，Co-IP验证其也是互作的。并且tet8/tet9双突变体展示出更感病的表型(F3B)，并且在双突变体中，转移到真菌细胞的sRNAs是减少的(F3C)。这也就说明，TET8和TET9联系的外泌体通过传递sRNAs到真菌细胞中来阻断真菌侵染。

    使用sRNAs合成的突变体，dcl2/3/4（破坏了tasiRNA的产成），rdr6（破坏了tasiRNA的形成），这些突变体展示出更感病的表型(F4AB)，这说明sRNAs能抑制病原菌的侵染。我们猜测sRNAs会靶向灰霉菌的毒性基因，通过预测发现拟南芥囊泡中的sRNAs靶向灰霉菌囊泡运输途径的基因，并且这些预测的靶基因在侵染后是下调的，但在dcl2/3/4和rdr6突变体中并不下调(F4C)。真菌的AGO蛋白有核糖核酸酶活性，能够切割sRNAs的靶基因，作者在被侵染的组织中检测到被切割的靶基因，这就说明植物sRNAs沉默真菌的靶基因通过mRNA切割的方式。

    在真菌中沉默囊泡运输的基因，再接种发现，灰霉菌的致病力下降，因此说明囊泡运输的基因对灰霉菌的致病力很重要。在拟南芥中过表达囊泡运输的sRNAs发现增强了拟南芥对灰霉菌的抗性，并且相应灰霉菌的靶基因也下调。这就说明跨界的sRNAs增强宿主抗性是通过沉默真菌基因。

后记

生物是个整体，不同物种及模式系统可以相互借鉴。

外泌体细胞保存液是做什么的？

细胞保存液起到保持、固定细胞原形态结构的作用，是病理细胞诊断基础，因为如果细胞形态结构发生变化，可能会带来诊断结果的误差，所以需要细胞保存液进行固定细胞形态，细胞保存液也是液基细胞试剂的核心构成。

液基薄层细胞制片检查系统处理技术诞生于1991年美国等国家，率先应用于妇科细胞学检查，国内从2001年开始作液基细胞学筛查宫颈癌的研究，使该项技术得到迅速发展，被称之为一场细胞学制片技术的革命。

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细胞保存液适用于宫颈脱落细胞检查、胸腹水脱落细胞检查、尿沉渣检查、痰液脱落细胞检查、针吸细胞检查，基本上病理科、妇科、内科、外科、泌尿科等科室会用到。液基薄层胞学检测技术特别适用于所有的女性的宫颈癌的早期诊断,是一项非常值得推广应用的临床检验技术。

脱落细胞保存液适用于各类脱落细胞如宫颈粘液、阴道分泌物、痰、鼻咽分泌物及其它粘稠性标本的处理，以佳效果进行细胞形态学检查，可以溶解、去除各类脱落细胞标本中影响显微镜下可见的粘液、杂质，便于病理学及细胞学检查。

液基细胞检测试剂盒主要由细胞保存液、细胞裂解液、提取液、稀释液、消化酶、防腐剂等及必要的细胞承载或制片器具组成，用于临床检验分析前细胞或微生物的保存、运输、提取、分离、沉淀、固定、制片等，用于各类脱落细胞如宫颈粘液、阴道分泌物等标本的处理，以佳效果进行宫颈癌筛查、炎症、HPV滴虫、霉菌等细胞形态学检查。

综上所述，细胞保存液是液基细胞检测试剂盒的成分之一，主要作用是为了保存和稳固细胞。

液相进样瓶能放在-80冰箱吗

可以，但是看要保存什么样品。

液相进样瓶 常常配合使用在岛津，光谱物理，瓦里安，以及其他自动进样器上，瓶子由无色1级A型或者琥珀色1级B型硼硅玻璃制成，并附可书写标签，用于样品鉴别。

实验方法：对HEK 293的细胞培养上清提取分离外泌体，将外泌体样本分成4组，分别保存在-70℃、-20℃、4℃和室温下10天后，进行Western Blot检测，选择的marker为HSP70、CD63、CD9。实验结果：结果显示，在-20℃和-70℃下保存的外泌体比较完整无损，而4℃和室温下CD63已基本没有表达，室温保存条件下HSP70的表达量也有所降低。

外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论

外泌体和微囊泡是几乎所有类型的细胞都能释放的细胞外囊泡(ev)的两大类，在生物液体中非常丰富，ev的分子组成和释放都被认为是受到外界刺激的严格调控的。多项研究一致表明，ev可以在不同的细胞类型之间转移蛋白质、脂质和RNA，从而介导细胞间的通信和信号转导。重要的是，ev中的小非编码rna被认为是在受体细胞中发生的分子事件的主要贡献者。

此外，外泌体和微囊泡中的RNA可以作为多种疾病的非侵入性的生物标志物，包括免疫系统的病理变化。

这篇综述旨在提供ev相关RNA转录组领域的最新技术，以及对以往使NGS测序来描述不同细胞释放的ev中RNA含量的研究进行全面分析。最后，我们强调了与获得纯EV和 EV相关RNA的深度测序 相关的技术挑战。

细胞外囊泡分为三种类型（ classifified by their origin and biogenesis）：apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs, also known as shedding vesicles), and exosomes。

大肿瘤小体(LOs)已被确定为第四种类型的ev，它是由肿瘤细胞脱落的膜泡产生的，其大小与 ABs相似。

它们直径大小不一，包含物也有所差异：MVs和外泌体包含各种细胞质和膜解蛋白以及脂质、糖和核酸（9），而ABs可能还包括核组分和细胞器。

marker特征差异：外泌体特征良好的蛋白标记物包括各种四酯蛋白，如CD9、CD63和CD81；而mv包含质膜常见的跨膜蛋白，如整合素和选择素；同时，ab可以通过组蛋白的存在来区分。

在多种早期RT-qPCR技术以及最近的报道中，外泌体和MV中的mRNA、miRNAs和lncRNAs得到了一致的证实。更先进的高通量RNA测序方法的应用揭示了，从生物液体和细胞条件培养基中分离的ev亚群中存在各种其他RNA种类。

这些RNA种类包括snRNA、snoRNA、piRNA、vault RNA、Y-RNA、scRNA、SRP-RNA和7SK-RNA；以及来自rRNA、tRNA、mRNA、lncRNA和各种基因间重复序列的短片段。

TABLE 1 | 使用高通量测序显示EV转录组含量的报告

Nolte-‘tHoen等人通过高通量测序研究了培养过程中免疫细胞释放的EV中的小RNA含量。从EV中分离出的总RNA大部分是小RNA (200 nt)，含有少量的18S和28SrRNA。这些短RNA片段主要定位于蛋白质编码区和基因组重复序列，包括SINE、LINE和LTR序列。相反，细胞小RNA群体中存在的大部分序列代表miRNAs，而细胞分泌的EV中miRNAs的比例显著较低。

除了编码mRNA和重复序列的蛋白质外，EV组分还包含所有类型的结构RNA(如vaultRNA、Y-RNA、snRNA、snoRNA、SRP-RNA和tRNA)以及来自lncRNA和假基因的片段。

此外，相对于细胞RNA来说，许多小非编码转录本在EVs中富集，这表明细胞可能选择特定RNA进行细胞外释放。

许多其他研究也证实，由各种培养细胞释放的外泌体中，miRNA 的表达明显低于其他种类的 RNA，这些数据与先前的观察结果一致，即大多数个体外泌体不携带任何生物学上有意义的 miRNA 拷贝。然而，其他的 RNA 测序实验表明，一些细胞系释放的外泌体中相当大比例的小 RNA-seq reads仍然与 miRNA 相对应。

有趣的是，几个独立的小组观察到有15-50% total reads RNA 片段比对到包括逆转录病毒序列，LTR，SINE，和 LINE 序列的基因组重复序列。需要指出的是，作者并没有明确说明在上述研究中使用的小 RNA 文库制备方案是否包括允许捕获5′-OH 和/或3′-磷酸化 RNA 的修饰。因此，目前尚不清楚他们是否真的在相应ev中表征了小RNA的全谱特征。

Jenjaroenpun 等人和 Miranda 等人分别报道了在 MDA-MB 细胞培养液和尿液 EVs 中总 rna (包括长 rna 和小 rna)的测序，并显示了相当比例的 rRNA 读数(87-97%) ，与细胞质中的 rRNA 含量相似。在剩下的3-13% 的片段中，大约一半被标记为蛋白质编码转录本，另一半则标记为非编码 rna 和基因组重复序列。

在Beradrocco等人的另一篇报道中，作者分别使用total RNA和sRNA测序protocols来表征四种不同肝癌细胞系释放的EV中封装的长RNA谱。总RNA片段比对到rRNA的比例最大(32-66%)，而基因组重复序列的比例为15-44%，只有11 -25%的片段映射到蛋白编码和非编码RNA基因。对相同EV制剂进行的sRNA测序显示，RNA类别的分布略有不同:rRNA(16-54%)、基因组重复序列(24-40%)和转录组(24-51%)。

在另一项与small RNA测序相平行的全转录组RNA-seq研究中，Lasser等人证实，人类mast和红白血病细胞系释放两个外泌体群体(通过密度梯度浮选分离为HD和LD组分。在HD和LD部分中，长和短RNA cargo明显缺乏相关性，这表明这两个部分的细胞外RNA与不同的通路相关。与LD外泌体相比，HD中mRNA转录本的reads比例更丰富(75 vs. 20%)，而非编码RNA的分布则相反(25 vs. 80%)。 在 short RNA libraries，HD部分富集成熟miRNA(23%)，而LD部分主要是tRNA(28%)和成熟miRNA(10%)。

另一项研究研究了黑色素瘤细胞在培养过程中释放的三种不同EV类型的RNA含量，并确定了一些非编码RNA在每个EV样本中富集。RNA图谱表明，在相对中等水平的sRNA水平的ABs和MV中存在显著的18S和28S rRNA峰。相比之下，外泌体主要包含小RNA，与ABs和mv相比rRNA更少。尽管EV亚群的miRNA装载量与外泌体略有不同，但大量的miRNA仅在外泌体中被检测到，而在ABs和MV中均不存在，这支持了外泌体富集特异RNA的概念。必须指出的是，与miRNA相比，其他ncRNA种类不仅显著丰富，而且选择性富集在黑素瘤细胞释放的不同EV亚型，这增加了研究细胞外囊泡RNA货物及其功能的复杂性。

到目前为止，只有少数报道对从人类生物液体中分离的EV中的小RNA货物进行了下一代测序。这些研究表明，从人血浆、唾液和尿液中分离出的外泌体含有相当比例的miRNA reads(35-76%)。

上述生物流体EV中其余的RNA种类包括rRNA、lncRNA、tRNA、mRNA、重复区域以及小的非编码RNA如piRNA、snRNA、snoRNA等。值得一提的是，与“几天”细胞条件培养基相比，从生物体液中分离出的外泌体可能含有大量的大蛋白聚集物，包括通常在细胞死亡时释放的装载mirna的AGO复合体。因此，在人类体液中检测到的miRNAs是否确实与ev相关仍有待验证。

有趣的是，对尿液外泌体纯化的总RNA进行深度测序发现，其转录本分布与Cheng等人(48)观察到的完全不同。具体来说，大部分(约87%)的RNA reads被映射到rRNA上，只有约8%的reads被映射到非编码RNA和DNA重复序列上，而剩下的约5%对应于蛋白质编码RNA。相反，Miranda等报道的图谱统计和reads分布与细胞条件培养基中外泌体的总RNA测序结果相似。

综上所述，从上述研究演变而来的集体证据(表1)认为，大多数细胞释放的EV确实携带大量的非编码转录本和蛋白质编码转录本，以及它们的部分，在研究细胞外RNA对受体细胞的影响时应该考虑这些。

EVs RNA载物含量的差异可能部分是因为:

外泌体对护肤的作用是什么？

外泌体是细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，其中含有多种miRNA、蛋白质和细胞调控因子；经研究发现，外泌体可以在细胞间进行通讯，传递生物信息和蛋白质，起到调节受体胞的作用。

通俗点来说，外泌体就像是带着由原细胞所发出的各种任务信息的“通信兵”，如“加快生产”~促进细胞新生和胶原合成；“降低成本”~降低炎症因子，修复细胞和组织老化损伤；“消除隐患”~降低皮肤基质降解，维持皮肤紧实弹性等各种信息，当外泌体将信息传递到受体细胞的时候，受体细胞就会接收这些信息并按照要求快速地行动起来，从而实现我们对受体细胞的调节和改善。

理论上任何种类的细胞都可以分泌外泌体；不过，目前在护肤领域展开研究的外泌体主要是来自人类多能诱导干细胞（IPSC）、骨髓间充质干细胞（MSC）和人真皮成纤维细胞（HDF）。

2019年8月，在美国北卡罗来纳大学所做的多项最新研究中证实：外泌体具有显著的皮肤抗老效果。