流式检测免疫细胞画门的策略（流式细胞术进行定位检测）

流式细胞术的作用原理

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他造血干细胞一针多少钱呀生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了激素脸怎么自我护理细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

流式细胞仪分析技术及应用

在2019年的三月份我过敏皮肤怎么护理正式开始做单细胞相关研究工作，有趣的同时也是朋友我们经常误会的是：你是不是用流式细胞术？而我在得知自己要做这单细胞（single cell ）的研究时，在Google搜关键词（single cell ），居然有不少是介绍流式细胞术的。流式细胞术应用到高通量测序领域就变成了微流控技术。可见，把生命科学的视界拉倒单细胞水平的比高通量测序更早的是流式细胞术。

那么在单细胞测序技术出现之前，人们在研究单细胞的时候都是怎么做的呢，都有哪些分析点呢？单细胞测序技术给单细胞研究带来了哪些新的视角？这一切的答案都要求我们对流式细胞术有一个基本的了解。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。

采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。

（1） 液流系统

（2） 光学系统

（3） 数据处理系统

激光光源：气冷式氩离子激光器

分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长

光束成形器：两十字交叉放置的透镜

透镜组：形成平行光，除去室内光

滤片：长通、短通、带通

光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）

测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。

荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。

每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。

选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。

线性放大器和对数放大器

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。

FS：反映颗粒的大小

SS：反映颗粒的内部结构复杂程度

FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少

单参数直方图

双参数直方图:点图

二维等高图

假三维等高图

三参数直方图

多参数分析

双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。

双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。

等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。

曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。

等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

流式细胞仪(FCM)是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

①细胞生物学 ：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 [详细]

②肿瘤学 ：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 [详细]

③免疫学 ：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 [详细]

④血液学 ：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 [详细]

⑤药物学 ：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 [详细]

细胞凋亡研究 ：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。 [详细]

** 细胞分选**：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。 [详细]

** 细胞因子的检测**：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。 [详细]

** 血液学应用**：本文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等。 [详细]

流式细胞仪检测有个设门法.怎样设门

所谓的门，在流式细胞仪检测的时候术语叫做gate。

流式细胞仪是针对细胞（后者颗粒）的群来做研究的。往往是先选中感兴趣的一个细胞群，再分析下一步的染色，可以进行很多分级。比如先从所有细胞中画出淋巴细胞，可以在FSC-SSC散点图上画出淋巴细胞的群，比如一个方框，或者任意曲线的gate，也就是所谓的门。把淋巴细胞括在内。然后在另外一个散点图上只显示这个gate里的细胞，但是把横坐标和纵坐标改为其他荧光标记。

总之，门就是一个选择细胞群的手段。

流式细胞技术的基本概念

流式细胞技术（flow cytometry,FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。 1.使各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测；2.针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态；3.对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液；4.对石蜡包埋组织应先切成若干40-50um厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再用前述方法制备单细胞悬液；5.单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。

流式细胞技术的应用：1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2.能准确地进行DNA倍体分析；3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4.快速进行细胞分选和细胞收集；5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。

请教流式细胞的具体实验步骤是怎样的？

一 、细胞表面标记的检测

1.试剂平衡至室温。准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。

2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454----

3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。加血前摇匀血样。

4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟。

5.离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。

6.加入PBS洗液2ml，震荡，离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。

7.加入PBS 900l。上机前4度保存。

8.上机。

二 、细胞内细胞因子的检测

1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。

2.写编号纸并编号。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3

3.（3－5在超净台操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。

4.刺激：取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640进行稀释一倍，加入刺激剂PMA，离子霉素和BFA，混匀。最后在全血中的终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1g/mlBFA：10g/ml。

5.37℃，5% CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖) 。

6.胞外染色：各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀，室温避光20分钟。

7.溶血：每管加入溶血素2ml，室温避光10分钟。离心，1200转， 5分钟。弃上清。

8.破膜通透：每管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2mlPBS，1000转，离心5分钟。弃上清。

9.胞内染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l，混匀，室温避光30分钟。加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。

10.加入PBS 500l。上机前4度保存。

11.上机检测。

注意：本实验室可提供流式细胞检测服务或流式细胞仪,不会的新手可以自行上门观察.本实验室为正规三甲医院科研共享平台,所有开放的实验均为本实验最常规的技术服务,暂时开放的除了流式细胞术外还有荧光定量pcr,ChIP免疫沉淀,wester blot,细胞培养,细胞株.

流式细胞术的步骤？

流式细胞仪的操作和使用①打开电源，对系统进行预热； ②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统； ③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统； ④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小； ⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程； ⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统； 　 　⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理； ⑧将所需结果打印出来。 细胞凋亡研究：细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。

　 细胞分选：流式细胞仪能够分选某一亚群细胞,分选纯度＞95%。目前细胞分选主要用于研究，临床应用较少。利用流式细胞仪分选免疫担当细胞进行细胞免疫学研究也是目前的热门课题。流式细胞仪能够分选出你想得到的任何一亚群细胞，只要你想得到的某一亚群细胞有合适的单克隆抗体标记。　 细胞因子的检测：随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。本文主要对胞内细胞因子流式细胞技术作介绍。　 血液学应用：文向您介绍流式细胞仪在血液研究领域的应用，包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等