外泌体表面标记蛋白几个（外泌体表面标记蛋白几个正常）

本文目录一览：

• 1、什么是外泌体？
• 2、外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论
• 3、细胞外泌体是什么？
• 4、什么是外泌体_外泌体是什么？

什么是外泌体？

什么是外泌体

人到中年，最难以启齿的矛盾便是脸上越来越多的皱纹和内心与日俱增的

“抗老需求”之间的矛盾。为了今天的容颜不被明天改变，什么玻尿酸、水光针甚至是干细胞美容，我都勇于“尝鲜”。而作为美容界的后起之秀——“外泌体”，我更是不愿错过。毕竟它虽然是近两年兴起的美容模式，但其发展历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是有口皆碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“江湖大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体，从字面上看，就是细胞向外分泌的物体。科学释义是：细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。

外泌体的作用机理

外泌体最大的功能便是人体的“通信兵”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞货拉拉”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“卸货搬家”。

希吉亚外泌体分离方法

外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，希吉亚外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法等。

Ø

超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。

希吉亚外泌体美容机制

Ø

免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。

促进细胞再生。外泌体可以有效刺激受体细胞，释放细胞活力，促进其再生和新生。因而可以帮助淡化祛除斑点，促使肌肤光亮细腻。

修复受损细胞。外泌体外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成，从而让帮助修复受损的肌肤屏障。而且它可以提高受损部位的修复能力和愈合能力。

抑制炎症产生。外泌体可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而降低了巨噬细胞诱发炎症反应的能力，从而抑制炎症。我们肌肤的很多问题都与肌底炎症有关，而外泌体可以通过抑制炎症来让肌肤从内而外的健康起来。

干细胞疗法围绕使用完整细胞来替代丢失的组织。相反，外泌体是与细胞分离的囊泡。外泌体促进恢复青春活力的方式是利用外泌体中携带的有效成分来帮助其他细胞。

干细胞和外泌体的另一个主要区别是前者仅从身体的特定部位获得，例如：骨髓、血液、脂肪组织。而外泌体，可以从几乎所有类型的细胞中获得。胎盘中也含有大量的外泌体。

通过上述科普，大家对外泌体美容一定有了更全面的认识

外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论

外泌体和微囊泡是几乎所有类型的细胞都能释放的细胞外囊泡(ev)的两大类，在生物液体中非常丰富，ev的分子组成和释放都被认为是受到外界刺激的严格调控的。多项研究一致表明，ev可以在不同的细胞类型之间转移蛋白质、脂质和RNA，从而介导细胞间的通信和信号转导。重要的是，ev中的小非编码rna被认为是在受体细胞中发生的分子事件的主要贡献者。

此外，外泌体和微囊泡中的RNA可以作为多种疾病的非侵入性的生物标志物，包括免疫系统的病理变化。

这篇综述旨在提供ev相关RNA转录组领域的最新技术，以及对以往使NGS测序来描述不同细胞释放的ev中RNA含量的研究进行全面分析。最后，我们强调了与获得纯EV和 EV相关RNA的深度测序 相关的技术挑战。

细胞外囊泡分为三种类型（ classifified by their origin and biogenesis）：apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs, also known as shedding vesicles), and exosomes。

大肿瘤小体(LOs)已被确定为第四种类型的ev，它是由肿瘤细胞脱落的膜泡产生的，其大小与 ABs相似。

它们直径大小不一，包含物也有所差异：MVs和外泌体包含各种细胞质和膜解蛋白以及脂质、糖和核酸（9），而ABs可能还包括核组分和细胞器。

marker特征差异：外泌体特征良好的蛋白标记物包括各种四酯蛋白，如CD9、CD63和CD81；而mv包含质膜常见的跨膜蛋白，如整合素和选择素；同时，ab可以通过组蛋白的存在来区分。

在多种早期RT-qPCR技术以及最近的报道中，外泌体和MV中的mRNA、miRNAs和lncRNAs得到了一致的证实。更先进的高通量RNA测序方法的应用揭示了，从生物液体和细胞条件培养基中分离的ev亚群中存在各种其他RNA种类。

这些RNA种类包括snRNA、snoRNA、piRNA、vault RNA、Y-RNA、scRNA、SRP-RNA和7SK-RNA；以及来自rRNA、tRNA、mRNA、lncRNA和各种基因间重复序列的短片段。

TABLE 1 | 使用高通量测序显示EV转录组含量的报告

Nolte-‘tHoen等人通过高通量测序研究了培养过程中免疫细胞释放的EV中的小RNA含量。从EV中分离出的总RNA大部分是小RNA (200 nt)，含有少量的18S和28SrRNA。这些短RNA片段主要定位于蛋白质编码区和基因组重复序列，包括SINE、LINE和LTR序列。相反，细胞小RNA群体中存在的大部分序列代表miRNAs，而细胞分泌的EV中miRNAs的比例显著较低。

除了编码mRNA和重复序列的蛋白质外，EV组分还包含所有类型的结构RNA(如vaultRNA、Y-RNA、snRNA、snoRNA、SRP-RNA和tRNA)以及来自lncRNA和假基因的片段。

此外，相对于细胞RNA来说，许多小非编码转录本在EVs中富集，这表明细胞可能选择特定RNA进行细胞外释放。

许多其他研究也证实，由各种培养细胞释放的外泌体中，miRNA 的表达明显低于其他种类的 RNA，这些数据与先前的观察结果一致，即大多数个体外泌体不携带任何生物学上有意义的 miRNA 拷贝。然而，其他的 RNA 测序实验表明，一些细胞系释放的外泌体中相当大比例的小 RNA-seq reads仍然与 miRNA 相对应。

有趣的是，几个独立的小组观察到有15-50% total reads RNA 片段比对到包括逆转录病毒序列，LTR，SINE，和 LINE 序列的基因组重复序列。需要指出的是，作者并没有明确说明在上述研究中使用的小 RNA 文库制备方案是否包括允许捕获5′-OH 和/或3′-磷酸化 RNA 的修饰。因此，目前尚不清楚他们是否真的在相应ev中表征了小RNA的全谱特征。

Jenjaroenpun 等人和 Miranda 等人分别报道了在 MDA-MB 细胞培养液和尿液 EVs 中总 rna (包括长 rna 和小 rna)的测序，并显示了相当比例的 rRNA 读数(87-97%) ，与细胞质中的 rRNA 含量相似。在剩下的3-13% 的片段中，大约一半被标记为蛋白质编码转录本，另一半则标记为非编码 rna 和基因组重复序列。

在Beradrocco等人的另一篇报道中，作者分别使用total RNA和sRNA测序protocols来表征四种不同肝癌细胞系释放的EV中封装的长RNA谱。总RNA片段比对到rRNA的比例最大(32-66%)，而基因组重复序列的比例为15-44%，只有11 -25%的片段映射到蛋白编码和非编码RNA基因。对相同EV制剂进行的sRNA测序显示，RNA类别的分布略有不同:rRNA(16-54%)、基因组重复序列(24-40%)和转录组(24-51%)。

在另一项与small RNA测序相平行的全转录组RNA-seq研究中，Lasser等人证实，人类mast和红白血病细胞系释放两个外泌体群体(通过密度梯度浮选分离为HD和LD组分。在HD和LD部分中，长和短RNA cargo明显缺乏相关性，这表明这两个部分的细胞外RNA与不同的通路相关。与LD外泌体相比，HD中mRNA转录本的reads比例更丰富(75 vs. 20%)，而非编码RNA的分布则相反(25 vs. 80%)。 在 short RNA libraries，HD部分富集成熟miRNA(23%)，而LD部分主要是tRNA(28%)和成熟miRNA(10%)。

另一项研究研究了黑色素瘤细胞在培养过程中释放的三种不同EV类型的RNA含量，并确定了一些非编码RNA在每个EV样本中富集。RNA图谱表明，在相对中等水平的sRNA水平的ABs和MV中存在显著的18S和28S rRNA峰。相比之下，外泌体主要包含小RNA，与ABs和mv相比rRNA更少。尽管EV亚群的miRNA装载量与外泌体略有不同，但大量的miRNA仅在外泌体中被检测到，而在ABs和MV中均不存在，这支持了外泌体富集特异RNA的概念。必须指出的是，与miRNA相比，其他ncRNA种类不仅显著丰富，而且选择性富集在黑素瘤细胞释放的不同EV亚型，这增加了研究细胞外囊泡RNA货物及其功能的复杂性。

到目前为止，只有少数报道对从人类生物液体中分离的EV中的小RNA货物进行了下一代测序。这些研究表明，从人血浆、唾液和尿液中分离出的外泌体含有相当比例的miRNA reads(35-76%)。

上述生物流体EV中其余的RNA种类包括rRNA、lncRNA、tRNA、mRNA、重复区域以及小的非编码RNA如piRNA、snRNA、snoRNA等。值得一提的是，与“几天”细胞条件培养基相比，从生物体液中分离出的外泌体可能含有大量的大蛋白聚集物，包括通常在细胞死亡时释放的装载mirna的AGO复合体。因此，在人类体液中检测到的miRNAs是否确实与ev相关仍有待验证。

有趣的是，对尿液外泌体纯化的总RNA进行深度测序发现，其转录本分布与Cheng等人(48)观察到的完全不同。具体来说，大部分(约87%)的RNA reads被映射到rRNA上，只有约8%的reads被映射到非编码RNA和DNA重复序列上，而剩下的约5%对应于蛋白质编码RNA。相反，Miranda等报道的图谱统计和reads分布与细胞条件培养基中外泌体的总RNA测序结果相似。

综上所述，从上述研究演变而来的集体证据(表1)认为，大多数细胞释放的EV确实携带大量的非编码转录本和蛋白质编码转录本，以及它们的部分，在研究细胞外RNA对受体细胞的影响时应该考虑这些。

EVs RNA载物含量的差异可能部分是因为:

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

什么是外泌体_外泌体是什么？

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。